荧光定量的原理及过程介绍
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量PCR原理及应用一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。
本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。
二、荧光定量PCR原理2.1 PCR基本原理回顾在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。
1.变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。
2.引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。
引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。
引物结合到待扩增片段上。
3.延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。
通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。
2.2 荧光定量PCR原理荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。
荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。
1.引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。
2.荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。
3.荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。
TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。
在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。
4.实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。
荧光定量PCR的原理及其应用
荧光定量PCR的循环过程
变性
在95℃下，DNA双链被打开，形成单 链模板。
延伸
在72℃下，DNA聚合酶从引物3'端开 始延伸DNA链。
退火
感谢您的观看
THANKS
定量分析。
引物设计
引物是荧光定量PCR反应的关 键，用于扩增特定的DNA片 段。引物设计需遵循一定的 原则，如特异性、长度、GC 含量等。
反应条件
荧光定量PCR反应需要设置适 当的反应条件，如温度、时 间、循环数等。这些条件直 接影响扩增效率和准确性。
荧光信号的收集和分析
荧光信号收集
在荧光定量PCR反应过程中，仪器会自动收集每个循环的 荧光信号。这些信号可以实时监测扩增过程，并用于定量 分析。
由于荧光定量PCR技术采用了标准曲线法， 可以建立统一的定量标准，使得不同实验 之间的结果具有可比性和可重复性。
缺点
成本较高
荧光定量PCR技术需要特殊的仪器设备和荧光染料，因此 相对于传统PCR技术，其成本较高。
操作复杂
荧光定量PCR技术的操作相对较为复杂，需要经过一定的 培训和技术指导才能获得准确的结果。
用将更加深入和广泛。
对未来发展的展望和挑战
要点一
展望
荧光定量PCR技术将继续发展，新方法和新技术的应用将 进一步提高其灵敏度、特异性和自动化程度。同时，荧光 定量PCR的应用领域也将不断拓展，为临床诊断和生物科 学研究提供更多有效的工具。
要点二
挑战
尽管荧光定量PCR技术已经取得了很大的进展，但仍存在 一些挑战和限制，如提高检测灵敏度和特异性、降低成本 和提高检测速度等。未来需要不断改进和完善技术，以适 应不断变化的需求和应用场景。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量法
荧光定量法一、引言在生物医学研究中，荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量样品中特定物质的浓度。
荧光定量法基于荧光现象，通过测量样品发出的荧光强度来确定目标物质的含量。
本文将详细介绍荧光定量法的原理、应用以及优缺点。
二、原理荧光定量法基于荧光现象，即当物质受到激发光照射后，能够吸收光能并发出辐射光。
荧光现象是由于物质的电子在激发态和基态之间跃迁所导致的。
在荧光定量法中，使用荧光染料或荧光标记的抗体等荧光探针与目标物质结合后，通过测量荧光强度来确定目标物质的浓度。
荧光定量法的基本原理如下： 1. 激发：使用特定波长的激发光照射样品，使样品中的荧光探针被激发到激发态。
2. 荧光发射：被激发的荧光探针从激发态跃迁回基态时，会发出荧光。
荧光的波长和强度与样品中目标物质的浓度相关。
3. 检测：使用荧光仪测量样品发出的荧光强度，并将其与标准曲线进行比较，从而确定目标物质的浓度。
三、应用荧光定量法在生物医学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：1. 生物分析荧光定量法可用于测量生物样品中的蛋白质、核酸、细胞等目标物质的浓度。
例如，可以使用荧光探针标记的抗体来定量检测特定蛋白质在细胞中的表达水平，或者使用荧光探针检测核酸序列的浓度。
2. 药物研发荧光定量法在药物研发中起着重要的作用。
通过荧光定量法可以测量药物在体内的药物浓度，评估药物的代谢和排泄情况，从而优化药物剂量和给药方案。
3. 环境监测荧光定量法可用于环境监测中，例如测量水样中的污染物浓度。
通过使用荧光探针与目标污染物结合，可以快速、准确地测量水样中的污染物含量，为环境保护提供重要参考。
4. 食品安全荧光定量法在食品安全领域也有应用。
例如，可以使用荧光探针检测食品中的有害物质，如重金属、农药残留等。
荧光定量法具有高灵敏度和高选择性，能够有效地检测食品中的微量有害物质。
四、优缺点荧光定量法作为一种常用的实验技术，具有以下优点： - 高灵敏度：荧光探针的荧光强度可以非常敏感地反映目标物质的浓度变化。
荧光定量pcr技术原理
荧光定量pcr技术原理荧光定量PCR技术（qPCR）是一种广泛应用于遗传学、病毒学、生物学以及医学等领域的分子生物学技术。
qPCR技术不仅能够准确快速地定量检测DNA模板，还可以检测RNA模板和蛋白质模板。
下面，将对qPCR技术的原理和步骤进行详细解释。
qPCR技术可以快速、精确地检测DNA，RNA和蛋白质等生物分子，其基本原理是通过PCR扩增反应，将DNA等靶分子浓缩，使其达到检测的限度。
同时，通过加入荧光标记的探针或引物，可以精确地记录反应的进程。
PCR反应完成后，荧光信号的变化可以直接反映出DNA分子的变化情况，进而得出浓度的定量结果。
qPCR反应主要包含两个步骤：PCR扩增基因片段和荧光信号检测。
PCR扩增基因片段的过程与普通PCR相同，但是在反应体系中加入荧光标记的探针或引物，所以荧光定量PCR反应的结果不仅表明结果是否出现，还可以定量检测出靶基因的数量。
因此，qPCR技术经常用于测定遗传性状、基因表达水平、微生物的定量，等等。
qPCR技术的优点主要体现在检测精度和灵敏度方面。
相对于传统的PCR技术，qPCR技术具有更高的检测灵敏度和更高的重复性，并且可以在较短的时间内处理大量样本；同时，qPCR技术可以在未开放区间（如DNA合成反应合成DNA的时候）检测反应的进程，这大大提高了实验的灵活性和可操作性。
2. 荧光定量PCR技术步骤（1）实验设计。
实验设计是qPCR技术的第一步，必须选择适当的引物和探针设计。
引物和探针的设计通常使用在线工具进行设计，二者均需具有较高的特异性，对非靶标序列不产生杂交效应，并且需要对目标序列具有较高的亲和性，以获得较好的扩增效果和检测结果。
（2）qPCR反应。
qPCR反应可以在各种qPCR仪器中进行。
在反应中，将提取的DNA或RNA按照设计好的引物和探针进行PCR扩增。
反应条件会因引物和探针的选择而有所不同。
反应结束后，qPCR仪器可以自动记录荧光信号变化，并计算扩增产物的数量，从而得出样品中目标序列的浓度。
荧光定量PCR的原理及应用
荧光定量PCR的原理及应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于荧光信号的分子生物学技术，用于定量检测目标DNA序列的数量。
它结合了传统的聚合酶链反应（PCR）技术和荧光探针技术，通过检测盘细胞PCR扩增过程中产生的荧光信号的数量来确定目标序列的初始模板DNA的量。
以下是荧光定量PCR的原理和应用相关内容。
1.原理：荧光定量PCR基于PCR扩增技术，通过DNA的双链不断不断的分离和扩增，形成指数级别的增加，从而使DNA数量可检测，实现定量的目标DNA检测。
在PCR反应体系中加入DNA荧光探针，该探针含有一个荧光染料和一个阻断器。
在PCR反应中，荧光探针与引物结合，并通过荧光染料发射荧光信号。
当引物与靶DNA序列结合时，即在扩增成产物的过程中，荧光探针被水解，导致发射的荧光不再受到阻断器的遮挡，荧光信号显著增加。
通过检测PCR反应中荧光信号的强度，来确定目标序列的初始模板DNA量。
2.应用：（1）基因表达分析：荧光定量PCR可用于分析特定基因在不同组织、细胞类型或疾病状态下的表达水平差异。
通过测量目标基因的荧光信号，可以定量表达水平。
（2）病原体检测：荧光定量PCR可用于检测并定量常见病原体的存在。
例如，通过检测病毒或细菌的DNA或RNA来确定其感染程度。
（3）遗传疾病诊断：荧光定量PCR可用于检测一些遗传疾病相关基因突变的存在，并定量突变的数量。
（4）细菌或病毒负荷检测：在一些感染疾病的监测中，荧光定量PCR可用于检测和定量病菌或病毒在患者体内的负荷，可用于监测治疗效果。
（5）环境微生物分析：荧光定量PCR可用于分析和定量土壤、水样和空气等环境中的微生物（如细菌、真菌和病毒）的存在和变化。
（6）转基因分析：在转基因研究中，荧光定量PCR可用于检测和定量外源基因的存在并分析其表达水平。
（7）单细胞分析：荧光定量PCR可用于对单个细胞中目标基因或突变的检测和定量。
这对于研究单细胞的异质性和功能以及肿瘤细胞的进化和耐药性等方面的研究具有重要意义。
定量PCR基本原理及方法
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型 突变型 杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程 中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定 的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
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10
特殊的吸收-增强效应
NiK(1.66Å) <FeK(1.94Å)< CrK(2.29Å)
X光管辐射直接激发的CrKα ：占CrKα辐射总量的72.5% FeKα辐射直接激发的CrKα：占CrKα辐射总量的23.5% ; NiKα辐射直接激发的CrKα ：占CrKα辐射总量的2.5% NiKα辐射激发的FeKα辐射激发的CrKα（第三元素激发）： 占CrKα辐射总量的1.5%
1
8
吸收-增强效应
吸收效应： 当初级辐射射入样品和样品产生的荧光射出样品时，受 样品原子的吸收导致荧光强度减弱的现象称为吸收效应； 是由于初级辐射和基体元素特征线的波长刚好位于分析 元素吸收限的短波侧。基体对于这些辐射的吸收系数可 能大于或小于分析元素的系数系数。
1
9
吸收-增强效应
增强效应： 分析元素的特征光谱线受共存的基体元素特征辐射的 激发导致分析强度的增加称为增强。基体元素特征线 波长位于分析元素吸收限的短波侧，使分析元素受到 基体辐射的强烈激发。
1
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定量分析中的基本问题
基体效应及其校正
基体效应是指：共存元素对分析线强度 的吸收和增强影响。基体指除分析元素 以外的元素。基体效应是分析误差的 主要来源之一。图中：
1. 以“ Alpha ”表示产生吸收影响的 路径，如Ni----Fe----探测器；
2. 以“ Normal ”表示的路径是元素受 激发产生的荧光不受任何影响直接 进入探测器，如Ni-------探测器。
基体分类：分成如下若干类型的基体： 当(/)M-B < (/)i时，属于轻基体 当(/)M-B (/)i时，属于中性基体 当(/)M-B (/)i时，属于重基体 当(/)M-B (/)B时，属于等效基体
1
6
基体效应的定义
基体效应: 样品中共存元素对分析元素光谱强度的影响。 在理想情况下,分析线的强度与元素浓度呈现简单的线性关系: RA,M = WA,M․RA,A 但由于样品中共存元素间存在基体效应很难实现这种关系。 多色激发时，荧光强度公式为：
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定量分析的基本问题
1. 基体效应 2. 光谱重叠影响 3. 背景影响 4. 定量分析方法 5. 样品制备
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基体效应
基 体: 是指样品中除分析元素外的其他组成元素.在多元体系中不同的分 析元素,具有不同的基体。考虑二次吸收－增强效应，总的基体对 于某个基体元素的吸收与增强影响，基体对于分析线的强度影响不 同与单个基体对于分析线的影响。
定量分析的原理及过程
PANalytical
1
1
荧光分析的应用范围
元素范围： 4 号铍 ( Be )~ 92 号铀 ( U ) 浓度范围： 0.x PPm ~ 100 % 样品形态： 金属、非金属、化合物、固 体、液体,
粉末、压片、固溶体和不规则样品
1
2
定量分析原理
X射线荧光分析法基本上就是一种测定出样品产生的X射线荧 光强度，然后根标准样品的X射线强度对比的比较方法。
1
12
Al-Si体系中的基体影响
质量衰减系数 2MAC (cm/g
AlK1.487kev
AlKab1.559kev
3100
SiK1.740 kev
2600
SiKab 1.838 kev
2100
E(Al KSi abs. ) : Si
由于现代光谱仪的自动化程度很高，仪器稳定性很好，分 析误差主要来源于样品制备和样品本身存在的基体影响。因此， 制定定量分析方法的关键是如何正确处理基体效应和制定适当 的样品制备方法。
1
3
X射线光谱定量分析的步骤
选择分析方法和制样方法。 激发分析元素特征谱线，涉及到X射线管和电源。 把二次光谱色散成孤立的分析线，以便单独测量。一般采 用波长色散和能量色散，也可采用两种色散的组合方式 进 行强度测量。 探测和测量。 把元素的X射线强度换算成元素浓度，这涉及到标样或计 算方法以及吸收-增强效应的校正。
100
90 80 70 60 50 40 30
20 10
0
0
20
40
60 80 100
SiO2 (%)
1
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铁-镍-铬体系的第三元素影响
NiK NiKab
Nik
FeK
FeKab
NiK FeK CrKab CrK
初级激发产生 的 CrK 的强度占Cr总强度的72.5%; 初级荧光 NiK同时激发 Fe 和Cr; 初级荧光FeK直接增强 CrK 占 Cr 总强度的23.5％; 初级荧光NiK的直接增强 CrK 占 Cr 总强度的2. 5％ 二次荧光FeK对CrK的增强占Cr 总强度的1.5％。
基体中Al K的低吸收；
1600
E(Si KAl abs. ) : Al
基体中Si K 的高吸收
1100
Al K Si K
600
100% Al2O3 100% SiO2
100
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
能量(keV)
1
13
Al-Si体系中的基体影响
最大计数率 KCPS
Ii =
Ki I 0W
()
(
A
i
) 0 ()
m
sin
m
sin
K
i "W
"
i
A
1
2
1
7
基体效应的分类
在光谱分析中基体对测量的分析线的强度影响可分为两 大类： (1) 吸收-增强效应：由于基体的化学组成引起 (2) 物理状态影响:由样品的粒度、均匀性，密度和表
面结构等因素所致。
3. 以“ Gamma ”表示的路径是以增 强效应为主，如Ni--Fe--Cr--探测器。
116Biblioteka 基体影响的校正方法1. 实验校正法：外标法、内标法、散射内标法、 比例稀释法等；
1
11
Al-Si体系中的基体影响
当分析元素的原子序数大于22（钛）时，与分析元素的原子 序数相差1或2的元素构成中性基体。对于中等和重元素，邻 近元素的吸收增强特性基本相似，以致可互作内标。当原子 序数减少时，邻近元素谱线的波长差和吸收系数差增大，致 使ZK线受Z1元素的强烈吸收。例如在铝(13)硅(14)共存的 氧化物体系中，尽管硅对A1K的吸收系数(500)比铝的自吸系 数(385)大，但SiK对A1K的强烈增强足以抵消硅的吸收 。