神经生物学实验报告动物脑的立体定位专业技术

脑立体定位技术及切片制备

一、实验目的

通过本实验,了解动物脑立体定位及切片制备,并基本掌握动物脑立体定位技术及切片制作。

二、实验设备及要求

实验分两部分：

Ⅰ大鼠脑立体定位（纹状体）

［器材和药品]

立体定位仪、10％水合氯醛溶液、1ml注射器、手术刀、粗剪刀、组织剪、

止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、３%双氧水（H

2O

2

)、生理盐水、

75%酒精,墨水。

[实验动物]

雄性SD大鼠（200-300 g）

Ⅱ大鼠脑切片制备

[器材和药品］

器械:手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ｍｌ注射器、6号针头、灌注瓶、恒冷切片机

液体：４％多聚甲醛溶液

三、实验步骤

Ⅰ大鼠脑立体定位(纹状体）

1. 立体定位仪的一般校验

2. 动物麻醉：动物称重后,水合氯醛溶液按３.6ｍl／kg作腹腔注射麻醉。

3．头部固定:

(1）插入耳棒：先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样插入固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称,轻移耳棒使两侧刻度一致头位完全居中,再次固定耳棒。三个标准检测是否固定成功：鼻对正中,头部不动,提尾不掉。

（２)固定上颌:将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部,均不应出现移动。通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上,并使前后囟在同一水平线上。

4．开颅：剪去头部的毛，用７5％酒精棉球作头部皮肤的消毒,沿矢状缝作切口,剥离筋膜及肌肉，推开骨膜,并用3%双氧水洗净，用干棉球擦拭，暴露骨缝,止血。

5．脑内核团定位:

（１)根据脑图谱,确定所要纹状体的立体位置，(纹状体:前囟前1 ｍm, 旁开2．5 mm, 深 3．5 mm)。

（2)用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后,在指定位置钻孔,有突破(落空)感后，停止钻孔。

６. 定位标记及组织学鉴定:

(１）定位标记:根据定位坐标,插入微量注射针，注入染料。

（2)组织学鉴定：动物处死后，大鼠用左心室—主动脉插管（右心室开孔,便于灌洗液流出）,先后用生理盐水和4％多聚甲醛溶液灌流固定, 取脑作冰冻连续切片,观察确定注射位置是否准确。(第二部分实验详述)

Ⅱ大鼠脑切片制备

1. 组织固定（灌注固定)

（1）减开胸腔，暴露心脏

(２）将注射针头插入左心室,减开右心耳

（３)放松输液管夹,先用生理盐水冲去血液,直至右心耳流出液体清亮无色（一般原则灌洗量不宜过多,灌洗时间不宜长。大鼠一般10０ml) （4）换以固定液继续灌流，先快后慢,固定液的量,大鼠一般为300-５00ml 左右

(５)开颅取脑，固定→切片

2．切片

切片刀的安置:刀的刃面与组织切面之间应有一定的角度,称为余隙角ａ。余隙角一般在2~５

组织冷冻:冷冻适度,过冷可致切片横向断裂、冷冻不足，切片容易厚薄不匀

切片：动作连贯

四、实验结果

了解了脑立体定位仪及切片制备基础知识,并在团队合作下完成了大鼠脑立体定位（纹状体)，以染料定位，以组学鉴定（切片）观察定位结果。本次试验定位空间上深度稍微欠妥，染料着色正常,切片制备正常。

五、讨论分析

立体定位技术指利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置,对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究。为此,掌握这门技术对于日后研究工作有非常大的帮助。

本次实验注意点有如下:

①大鼠固定：实验开始前,我们一直尝试用耳杆进行固定，但始终不能对齐。最后在老师的指导下,我们使用了耳杆适配器，很轻松的便完成了固定。

②游标卡尺在使用时一定注意记录读数，便于后期再次定位。

③注射染料时，速度一定要慢,给予组织充分的时间去吸收，不然极易导致染料冒出。

④微量注射针刺入大脑时，应注以针尖中后段为准,避免插入深度不足。

⑤取大脑时，为了不伤及脑组织，应从脊髓处入手；并在基本暴露大脑后,用钳子一并取出脑组织。

⑥切片时，镊子等工具使用完后应放回操作箱中保温；且切片取出后，应迅速将切片放入指定位置，以免融化。

此外,本次试验也有一些小的疑惑需要进行讨论:

①介于大鼠露骨较脆，可否不进行钻孔直接通过微量注射针打入染料。此法可以避免因移动坐标尺导致的误差,同时也可以保证颅骨处于封闭状态避免染料冒出。

②本次实验采用的取大脑方法极易损坏小脑，不利于小脑相关实验的使用。

实验者：丁力

学号:142112200３6

日期:2０14-9-27