免疫亲和色谱PPT幻灯片
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9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
23
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
18
9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
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作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
免疫亲和色谱
2014-7-21
IAC 的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。 能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
2014-7-21
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用 100 次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素 B1 、 B2 、 G1 、 G2 测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2014-7-21
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和 IAC 本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺 (polyacrylamide) 、三丙烯酰胺 (trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。 偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
04 免疫亲和色谱(解码)
第一章 亲和色谱法简介 ............................................................................................................................... 10 大规模制备的生物加工介质 ............................................................................................................................................... 13 用户定制设计介质和柱子 ....................................................................................................................................................13 在亲和色谱中通用术语 .........................................................................................................................................................14
GE Healthcation at work
ઠጲHFHealthcareڦ֩
Protein Purification Handbook 18-1132-29
Gel Filtration Principles and Methods 18-1022-18
Affinity Chromatography Principles and Methods 18-1022-29
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Protein Purification Handbook 18-1132-29
Gel Filtration Principles and Methods 18-1022-18
Affinity Chromatography Principles and Methods 18-1022-29
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
PTP课件
3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
PTP课件
4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
24
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
37
其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
38
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
30
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
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2021/3/8
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用100次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2021/3/8
2021/3/8
IAC的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。
能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价 键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。
免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论 上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免 疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物 的结合点。
分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于 在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免 疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶 液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理 论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子 时，才可近乎理论计算值。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2021/3/8
2021/3/8
IHale Waihona Puke C具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography, IAC)是极为有效的样品制备方法。IAC根据分析物和其 所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂 样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗 体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵 是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多 柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定 化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。 用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。 洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓 冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体 移至缓冲液，因此将分析物洗脱。
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用100次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2021/3/8
2021/3/8
IAC的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。
能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价 键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。
免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论 上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免 疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物 的结合点。
分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于 在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免 疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶 液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理 论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子 时，才可近乎理论计算值。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2021/3/8
2021/3/8
IHale Waihona Puke C具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography, IAC)是极为有效的样品制备方法。IAC根据分析物和其 所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂 样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗 体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵 是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多 柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定 化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。 用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。 洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓 冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体 移至缓冲液，因此将分析物洗脱。