免疫亲和色谱
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素
免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素作者：孙艳杰赵磊李正刚王路宏来源：《中国民族民间医药·上半月》2023年第12期【摘要】目的：建立免疫親和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。
方法：样品采用70％甲醇作为提取溶剂，经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生后，通过荧光检测器测定其中黄曲霉毒素的含量。
结果：黄曲霉毒素B1的线性范围为0.0104～0.0520 ng（r=0.999 9）、黄曲霉毒素B2的线性范围为0.0038～0.0190 ng（r=0.999 8）、黄曲霉毒素G1的线性范围为0.0108～0.0540 ng（r=0.999 8）、黄曲霉毒素G2的线性范围为0.0038～0.0190 ng（r=0.9998），线性关系良好，回收率在89.68%～101.44％之间，RSD≤3.5%。
结论：该方法操作简便，灵敏度高、重复性好、结果准确，可用于制马肾中黄曲霉毒素的测定。
【关键词】制马肾；免疫亲和柱；光化学衍生；高效液相色谱-荧光检测器；黄曲霉毒素【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）23-0019-04DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.23.zgmzmjyyzz202323005Simultaneous Determination of Content of Four Aflatoxins in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by Mmunoaffinity Column Clean-up and HPLC-FLD with Post-column Photochemical DerivatizationSUN Yanjie ZHAO Lei LI Zhenggang WANG Luhong*Siping Institute for Food and Drug Control，Siping 13600，ChinaAbstract：Objective To establish the contamination method of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by immunoaffinity column clean-up and HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization．Methods After extraction with 70% Methanol and purification by immunoaffinity columns，aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in samples were anlyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization.Results The linearity of Aflatoxin B1 was at 0.0104-0.0520 ng（r=0.9999）， Aflatoxin B2 was at 0.0038-0.0190 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G1 was at 0.0108-0.0540 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G2 was at 0.0038～0.0190 ng（r=0.9998）， The average recoveries were within 89.68%-101.44% wi th RSD≤3.5%. Conclusion The above method has demonstrated convenient operation，good repeatability，highsensitity and accuracy.This method is suitable for the determination of AF in Renshenguipi pills.Keywords：Equi Penis Et Testivulus；Immunoaffinity Column；Photochemical Derivation；HPLC-FLD；Aflatoxi马肾药材标准收载在《吉林省中药材标准》第二册2019版［1］，为马科动物成年马Equus caballus Linnaeus雄性的干燥阴茎及睾丸。
免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测食品中的双酚A
1
中 检 维 康
饮料：准确量取样品25mL于50mL容量瓶中，调节PH值7-8左右， 用 pH7.4 PBS溶液定容至50mL，准确 移取吸取下层液40.0 mL，备用。
1） 样品的净化 双酚A免疫亲和柱的柱容量(最大吸附双酚A)为500ng，当样品中双酚A超过测定范围时，请适当减小上 柱体积，使其在检测范围内，计算出准确含量。 牛奶,奶粉（测定范围：牛奶样品 0-50μg/L，奶粉样品 0-500μg/kg） 将免疫亲和柱连接于 20.0mL 玻璃注射器下。准确移取 20.0mL 样品提取液注入玻璃注射器中，将空气 压力泵与玻璃注射器连接， 调节压力使溶液以约 2mL/min （1 滴/秒） 流速缓慢通过免疫亲和柱， 直至 2~3mL 空气通过柱体。 以 2-3mL/min （1-2 滴/秒） 流速用 10.0mL 水淋洗柱子 1 次， 弃去全部流出液， 并使 2mL~3mL 空气通过柱体。准确加入 1.0mL 色谱级甲醇洗脱，流速为 1 mL/min ~2mL/min（1 滴/秒） ，收集全部洗 脱液于玻璃试管中， 50 C 下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至 0.5 mL，供 HPLC 或 LC-MS 分析。 饮料（测定范围： 0-25μg/L） 将免疫亲和柱连接于 50.0mL 玻璃注射器下。准确移取 40.0mL 样品提取液注入玻璃注射器中，将空气 压力泵与玻璃注射器连接， 调节压力使溶液以约 2mL/min （1 滴/秒） 流速缓慢通过免疫亲和柱， 直至 2~3mL 空气通过柱体。 以 2-3mL/min （1-2 滴/秒） 流速用 10.0mL 水淋洗柱子 1 次， 弃去全部流出液， 并使 2mL~3mL 空气通过柱体。准确加入 1.0mL 色谱级甲醇洗脱，流速为 1 mL/min ~2mL/min（1 滴/秒） ，收集全部洗 脱液于玻璃试管中， 50 C 下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至 0.5 mL，供 HPLC 或 LC-MS 分析。 婴幼儿米粉:（测定范围：0-100μg/kg） 将免疫亲和柱连接于 50.0mL 玻璃注射器下。准确移取全部 60.0mL 样品提取液注入玻璃注射器中，将 空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约 2mL/min（1 滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直 至 2~3mL 空气通过柱体。以 2-3mL/min（1-2 滴/秒）流速用 10.0mL 水淋洗柱子 1 次，弃去全部流出液， 并使 2mL~3mL 空气通过柱体。准确加入 1.0mL 色谱级甲醇洗脱，流速为 1 mL/min ~2mL/min（1 滴/ 秒） ， 收集全部洗脱液于玻璃试管中，50 C 下氮气浓缩吹干后， 用流动相定容至 0.5 mL， 供 HPLC 或 LC-MS 分析。 注：为了节约实验时间，可以省去氮气吹干的步骤，将 1.0mL 色谱级甲醇洗脱液直接注入 HPLC 检测 （前提是液相色谱仪条件允许） ，因此，检测灵敏度会降低 2 倍。 注意事项 1) 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。 2) 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。 3) 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过 10%，否则会影响 柱子的吸附能力。 4) 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏 低。 需要准备的设备及试剂（中检维康提供） C/N 编号 21022 物品 Clover 六位泵流操作架（配有 1 台空气泵，6 个20202 31955 31240 36010 34000 36020 35016 C546150-U C546250-U 高速匀质器，转速可达 18,000 r/min 22,000 r/min 美国 vicam 微纤维滤纸（1.5um，100 张/盒） 折叠式槽纹滤纸（100 张/盒） ，或中速定性滤纸 一次性塑料烧杯(25/包) 一次性测试管(250 支/包) 塑料漏斗(10 个/包) 色谱纯级的甲醇（4 升/瓶） Cloversil C18 反相色谱柱 4.6*150mm（5um） Cloversil C18 反相色谱柱 4.6*250mm（5um）
免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定坚果中黄曲霉毒素
０ １ ｇｋ ．Ｄ ｔｒ ｎ ｔ ｎ ａ ａｏ ｉｓＢｌ Ｂ２ Ｇｌ ｎ ｏ ｔｎ ｎ ｎ ｔｂ ｍｍｕ ｅａｆ ｉ ｏｕ ａ ａ ｉ ｓｍｐｅａ ｄ ．５ ／ ｇ ｅｅｍｉａｉ ｆ ｔｘｎ ， ， ｄ Ｇ２ ｎｅ ｔｉ ｕ ｙ ｉ ｏ ｌ ａ ｃ ｎ ｆｉ ｔ ｃ ｌｍｎ ｗ ｓａ ｒｐｄ， ｉ ｌ ｎ ｎｙ
第 ６ 总第 ２ １ 期（ １ 期）
２１ ０ ０年 ６月
农产品加Ｔ ・ 刊 学
Ａｃ ｄ ｍｉ ｅ ｉｄ ｃ ｌ ｆＦ ｒ Ｐ ｏ ｕ ｔ ｒ ｃ ｓ ｉ ｇ ａ ｅ ｃ Ｐ ｒｏ ｉ ａ ａ ｍ ｒ ｄ ｃｓ Ｐ ｏ ｅ ｓｎ ｏ
Ｎ０６ ．
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文 章 编 号 ：１７ — ６ ６ｆ ０ ０ ６ ０ ３ — ３ ６ １ ９４ ２ １ ０ — ０ ２ ０ １
０１ ｇ ｇ ． ５ ／ 。免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定坚果 中黄 曲霉毒素 Ｂ ，Ｂ，Ｇ ，Ｇ 总量 ，是一种简单 、快 速和准确 ｋ 。 ： ．
的方 法 。
关键词 ：黄曲霉毒素 ；免疫亲和柱 ；液相 色谱仪 ；坚果
中图 分 类 号 ：Ｔ ２７４ Ｓ０． 文 献 标 志 码 ：Ａ ｄ ｔ １． ６ ／ｓｎ１７ — ６ ６Ｘ ． １ ． ． ９ ｏ： ０３ ９ｊｓ．６ １ ９ ４ （） ０ ００ ０ ９ ｉ ２ ６０
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04 免疫亲和色谱(解码)
GE Healthcation at work
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Protein Purification Handbook 18-1132-29
Gel Filtration Principles and Methods 18-1022-18
Affinity Chromatography Principles and Methods 18-1022-29
黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备及应用
黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备及应用黄芪甲苷是黄芪中的一种有效成分，具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种药理作用。
为了更好地应用和研究黄芪甲苷，需要制备免疫亲和色谱介质来进行分离纯化。
本文将介绍黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备过程和应用。
一、材料与方法1.材料（1）黄芪甲苷纯品；（2）碳酸钠、氯化钾、氯化钠、甲醛、硫酸丙酮、乙二胺四乙酸、聚乙二醇、N-羟基丁二酰亚胺、1-己烯基二甲氨基溴化铵、羧甲基纤维素钠；（3）羊驼抗黄芪甲苷单克隆抗体；（4）聚丙烯酰胺凝胶；（5）超纯水。
2.方法（1）制备黄芪甲苷荷载的聚丙烯酰胺凝胶① 准备聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺粉末按照说明书的比例溶解在超纯水中，制备出10%的聚丙烯酰胺凝胶溶液。
② 将聚丙烯酰胺凝胶离心去泡沫，加入羧甲基纤维素钠，用磁力搅拌器混合均匀。
③ 将凝胶溶液倒入色谱柱中，等待凝胶凝固。
④ 用1 M碳酸钠溶液冲洗凝胶，去除未反应的羧甲基纤维素钠。
⑤ 用0.1 M酸性缓冲液（pH 2.5）冲洗凝胶，调节pH值。
⑥ 用0.1 M氯化钠溶液反复洗涤凝胶。
⑦ 将黄芪甲苷和1-己烯基二甲氨基溴化铵混合，加入凝胶中，使黄芪甲苷荷载在凝胶上，保持室温反应16小时。
⑨ 用硫酸丙酮洗涤凝胶，将反应产物固定在凝胶中，再用0.1 M氯化钠溶液洗涤凝胶，去除未固定的胺试剂。
购买羊驼的全血，离心分离出血清。
将血清加入黄芪甲苷纯品，将得到的免疫反应产物经过多次纯化和稀释，得出含有单克隆抗体的血清。
将荷载了黄芪甲苷的聚丙烯酰胺凝胶切成小块，将其与含有单克隆抗体的羊驼血清经过反复混合，使黄芪甲苷分子与抗体结合，得到黄芪甲苷免疫亲和色谱介质。
二、应用将制备好的黄芪甲苷免疫亲和色谱介质填充在色谱柱中，可用于黄芪甲苷的分离纯化。
将黄芪提取液先通过预处理步骤，去除污染物，再加入色谱柱中，经过复杂的色谱过程，可取得高纯度的黄芪甲苷。
三、总结。
免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素A的方法研究_张辉珍
2008, Vol. 29, No. 12食品科学※分析检测552免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素Ａ的方法研究张辉珍２，马爱国１，＊，李惠颖２，王晓滨２（１．青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 ２６６０２１；２．青岛市产品质量监督检验所，山东 青岛 ２６６０６１）摘 要：试样经甲醇－水或碳酸氢钠－水溶液提取，提取液稀释过滤后经过含有赭曲霉毒Ａ特异性抗体的免疫亲和柱层析净化，洗脱液用Ｃ１８（１５０×４．６０ｍｍ，５μｍ）色谱柱分离，荧光检测器测定。
流动相为乙腈：水：乙酸为９９：９９：２；激发波长３３３ｎｍ；发射波长４７７ｎｍ；柱温３５℃；进样量１００μｌ；外标法定量，结果表明，色谱峰面积与含量之间有良好的线性关系，方法的检出限为０．２μｇ／ｋｇ，加标回收率为９０．３％～１０６％，对不同浓度的样品相对标准偏差ＲＳＤ为１．７５％～４．３２％。
该方法操作简便、准确，回收率高、精密度良好、重现性好，可用于谷物、酒类、调味料等产品中赭曲霉毒素Ａ的测定。
关键词：赭曲霉毒素Ａ；免疫亲和层析净化；高效液相色谱Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｚｈｅｎ２，ＭＡ Ａｉ－ｇｕｏ１，＊，ＬＩ Ｈｕｉ－ｙｉｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｂｉｎ２（１．Ｉｎｓｔｉｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｑｉｎｇｄａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０２１， Ｃｈｉｎａ；２．Ｑｉｎｇｄａｏ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｔｙ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０６１， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ （ＯＴＡ） ｉｎ ｆｏｏｄｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ ｗａｔｅｒ ｏｒ ＮａＨＣＯ３ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ａｆｔｅｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔａｒｃｔｓ， ｆｌｏｗｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＯｃｈｒａＴｅｓｔ ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＯＴＡ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ＯＴＡ ｂｕｆｆｅｒ， ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ， ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｔｕｒｎ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｏｌｅｌｕａｔｅ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ Ｃ１８ （１５０×４．６０ ｍｍ，５μｍ） ａｔ ３５ ℃ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ ｗａｔｅｒ－ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （９９：９９：２， Ｖ／Ｖ） ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅａｔ ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．９０ ｍｌ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｓ ３３３ ｎｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ ４７７ ｎｍ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆＯＴＡ ａｒｅ ９０．３％ ｔｏ １０６％， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｒｅ１．７５％ ｔｏ ４．３２％ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＴＡ ｉｎ ｆｏｏｄｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ；ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｌｅａｎ－ｕｐ；ＨＰＬＣ中图分类号：ＴＳ２０７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０５５２－０３收稿日期：２００７－１０－１９作者简介：张辉珍（１９６６－），女，高级工程师，博士研究生，研究方向为营养与食品安全。
免疫亲和柱净化-高效液相色谱法同时检测鸡蛋中6种玉米赤霉醇类化合物残留量
准品， 纯度 ≥９ ． ％， 购 白美 国 Ｓｇ ８０ 均 ｉｍａ公 司 。
鸡 蛋 样 品 购 自超 市 。 １ ２ 溶 液 的 配 制 ．
标 准品储 备液 ： 准确 称取 一 米赤霉 醇 、一 玉 ＿ ＿ 丘米 赤 霉醇 、 玉米 赤 霉 烯 醇 、一 米 赤 霉 烯 醇 、 米 赤 一 玉 玉 霉 酮和 玉米赤 霉烯 酮 标 准 品 适量 ， 别用 甲醇 溶 解 分 并 稀 释 ， 制 成 质量 浓 度 均 为 １ ０ｍｇ Ｌ的标 准 品 配 ０ ／ 储 备液 。 混 合标 准 品工作 液 ： 分别 准 确 吸 取 各标 准 品储
乙酸钠 缓 冲液 ： 取 ６８ 称 ． ０ ｇ乙 酸 钠 ， ９ ０ｍＬ 用 ０
（Ａ 具 有 独特 的专 属 性 、 富 集 率 和 良好 的净 化 Ｉ Ｃ） 高
效能 ， 可显 著 提高检 测灵 敏度 ， 近年 来逐 渐用 于食 品 残 留检测 。但使 用 Ｉ Ｃ净 化 结 合 ＨＰ Ｃ同 时 Ａ Ｌ 测定 鸡蛋 样 品 中 ６种 玉米 赤霉 醇类 药物 残 留还 未 见 报 道 。本 文采 用 免疫 亲 和 柱 净化 ， 立 了 Ｈ Ｌ 同 建 ＰＣ 时 检测 鸡蛋 中 ６种 玉米 赤 霉 醇 类 化 合 物 残 留量 的
体瘦 肉率 。但 动物 实 验 表 明 ， Ｅ Ｚ Ｒ对促 性 腺 激 素 结合 受体 等有 抑制 作 用 ， 引 起人 体性 机 能 紊 乱及 会 影 响第二 性征 的正 常发 育 ， 外部 条件诱 导下 ， 可 在 还
能 致癌 。Ｚ Ｒ排 出动 物 体外 后 ， 可 经饮 水 和食 Ｅ 还 物 造成 二次 污染及 环境 污染 。 因此世界 各 国及 组 织 陆 续公 布法令 禁止 在畜 牧业 饲养 过程 中使用 这类 激 素 ，９ ６年 欧盟禁 止将 玉米 赤 霉 醇等 激 素类 药 物 应 １９ 用 于畜 禽养 殖 ， 国农 业 部第 ２ ５号公 告 明确 规 我 ３ 定 玉米 赤 霉 醇 禁 用 于 所 有 食 品 动 物 。 由 于 玉 米
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2014-7-21
IAC 的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。 能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
2014-7-21
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用 100 次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素 B1 、 B2 、 G1 、 G2 测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2014-7-21
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和 IAC 本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺 (polyacrylamide) 、三丙烯酰胺 (trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。 偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2014-7-21
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC ）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。 用 GC-MS 测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析 7 个同化激素，用 7 个单独的 IAC 基体合在一个柱中。
2014-7-21
2014-7-21
为了从IAC基体中洗脱分析物，柱中需要有 特定条件。洗脱步骤取决于抗体-分析物键的性质 ，一般是弱的物理性质的键。 由于免疫化学相互作用的物理键的类型在不 同抗体-分析物体系之间变化极大，因而每个抗体 的净化步骤有其自身的适宜洗脱条件。
2014-7-21
通常，以特定的或非特定的脱附方式进行洗脱 。特定的脱附如配体竞争和共底物洗脱；非特定的脱 附可用各种不同的步骤，全都瞄准在抗体 - 分析物复 合物的解离。据估计，在抗体 - 分析物键没有断开前 ，从1mL柱上洗脱l0ng需要大约25L洗脱体积。为了将 洗脱体积减少到 5mL ，必须改变柱内的条件，使其亲 和常数由5x1011 L/mol减小到108 L/mol。然而必须选 择洗脱条件，使亲和常数的减小是个可逆的过程。否 则，抗体会受到损坏致使免疫亲和柱的重复使用受到 极大的限制。这从经济观点来说是很重要的，因为仅 制备一个免疫亲和柱就需要几毫克抗体。
2014-7-21
IAC 具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对 IAC 还有更多要求。 IAC 基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、 ß- 激动剂、皮质激 素以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产 商业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
2014-7-21
在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价 键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。 免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论 上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免 疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物 的结合点。 分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于 在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免 疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶 液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理 论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子 时，才可近乎理论计算值。
免疫亲和色谱
一 二
发
三
四疫亲和色谱 (immunoaffinity chromatography, IAC) 是极为有效的样品制备方法。 IAC 根据分析物和其 所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂 样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗 体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵 是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多 柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定 化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。 用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。 洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓 冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体 移至缓冲液，因此将分析物洗脱。