4.3 亲和色谱

离心（10000rpm）或过滤（0.45或0.22μm滤膜）除去 不溶物 对复杂样品如组织细胞、植物材料、发酵产物，应预处 理，如超声破碎、溶解、均质、抽提、过滤、离心等 盐析、离子交换层析 透析或凝胶过滤完成脱盐、缓冲液交换
加样吸附
目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上 起始缓冲液的选择：配体-目标分子作用类型 疏水键，提高离子强度，不要采用低温操作； 离子键，降低离子强度 流速：低压亲和层析，流速50cm/h；高效液相 亲和层析，流速50～125cm/h。若结合力弱， 应降低流速 加样量：不超过亲和吸附剂的吸附容量
使用洗涤剂 极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白 最好使用在280nm附近无吸收的非离子型 洗涤剂，如NP-40, Lubrol
使用促溶盐（chaotropic salt） 促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏 水作用的强度
← 蛋白质沉淀（盐析）效应增加 阴离子：PO43－, SO42－, CH3COO－, Cl－, Br－, NO3－, ClO4－, I－, SCN－ 阳离子：NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ 蛋白质促溶（盐溶）效应增加 →
NADP
NADP依赖性脱氢酶
苯基硼酸盐 糖蛋白 Cibacron Blue F3G-A NAD(P)依赖性脱氢酶、激 酶、磷酸酶、白蛋白、干 扰素
Procion Red NAD(P)依赖性脱氢酶、干 HE-3B 扰素、抑制蛋白、纤溶酶 原
赖氨酸 纤溶酶、纤溶酶原、纤溶 酶原激活剂
单克隆抗体
特定抗原
过渡金属离 子
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
琼脂糖等多糖类载体
溴化氰法
最常使用，简单温和，活化效率高，速度快；反 应可逆，剧毒，可能带上电荷
接有连接臂的亲和层析用载体
载体
连接臂 3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基 3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基
供应商 Bio-Rad Bio-Rad ICN Pharmacia Serva Miles IBF Merck
琼脂糖
1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3’-二氨基二丙胺 1,6-己二胺, 6-氨基己酸 3,3’-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3’-二氨基丙基 胺 氨基烷基(2,4,6,8,10)
配体 目标分子 配体 目标分子
5’-AMP
ATP NAD
NAD依赖性脱氢酶、ATP 依赖性激酶
ATP依赖性激酶 NAD依赖性脱氢酶
Poly(U)
凝集素 蛋白质A /蛋白质G 钙调蛋白 肝素
真核mRNA、Poly(U)结 合蛋白
糖蛋白 IgG或IgG对应抗原 钙依赖性酶 某些凝固蛋白、血浆蛋 白、脂蛋白、核酸相关 酶、受体等
含组氨酸的多肽或蛋白 质
㈢ 配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合)
㈣ 配体的选择
1. 考虑亲和势 L+S LS Kl= [L][S]/[LS] 要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如……
㈠. ㈡. ㈢.
二、 加样吸附 样品平衡（透析或SephadexG-25） 样品体积Vs（一般＜5%） 若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小 洗去非吸附物（10Vt始缓洗）
三、洗脱（以S不变性为前提） 类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、 梯度或阶式洗脱。
样品准备
加样前样品应当澄清，不含颗粒状物质，有适当的pH值、 离子强度以利于目标分子的结合
亲和吸附剂的制备过程
封闭未反应的活化基团
载体上活化基团浓度
5~25mol/ml 偶联上的配体浓度 1~10mol/ml 封闭试剂 pH8.0，1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h
配体浓度评估 差示分析法
直接测定法 放射分析法 水解法
连接臂的连接 连接臂先接配体后偶联至载体
亲和层析过程演示
亲和吸附剂的构成 载体（基质）、配体、连接臂
说明： 1.偶联用Gel（须是活化偶联介质） 2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂
3.按相互作用力划分： 次级键——亲和色谱 配位键——螯合色谱 共价键——共价色谱 疏水键——疏水色谱
亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose
一般步骤：
冻干粉
溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
㈠.
溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 ㈡. 偶联条件 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH ㈢. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上 L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其 掩蔽。 ㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和 某些相对应的分子可逆结合的特性建立的 色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性
二、应用 高效从复杂混合物中得某一种物质； 基于生物功能可把有活性与无活性分开 三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
三、手臂（Spacer arm） 在载体和配基间引入适当长度的“手 臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的 活动度。 示意图如下：
连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短 对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂 （其长短对吸附的影响不大）； 疏水性手臂具体选择应考虑： ⑴ 分离物质分子量大小 ⑵ 亲和势大小 ⑶ 过长手臂易弯曲、折叠等； 最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和 3,3’-二氨基二丙胺。
亲和层析洗脱时常用的促溶剂有1～3mol/L硫氰 化钾、1～3mol/L碘化钾、4mol/L MgCl2 使用蛋白质变性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍
Step elution
Gradient elution
专一洗脱(亲和洗脱)
使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶 从染料柱上洗脱 使用能与配体结合的分子，如：用游离糖 将糖蛋白从凝集素柱上洗脱 优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性 缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后 需要进一步分离
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L
选偶联Gel 偶联L
装柱
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附 洗去非吸附物
亲和柱
再生
洗脱液
脱盐
一、亲和吸附柱的预备
㈠. 亲和吸附剂选择或制备 效能小试： 据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t ①. 用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸 附性能好，α＞0.9 ②. 不断加样到目的物流出，确定吸附容量 ㈡. 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般2～3Vt始缓
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单 E
A EA
P
E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
双底物依次

E
A
B
P Q
E EPQ EQ
EA EAB
须选择A、若选B则吸附时须加A
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ
A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的 大小和固定化的难易程度。
洗脱方式总结:
pH变化（破坏静电引力） I变化 （减弱静电引力、范德华力） 亲和洗脱 L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂 减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等 ㈠. ㈡. ㈢.
㈤. 解离试剂 主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等 ㈥. 降低温度t 较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力 ㈦. 电泳解吸 + 在柱两端连上电极进行电泳