第5章基因工程基本流程-筛选与鉴定

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选择过程
1）从重组克隆中提取质粒（或基因组DNA） 2）用相应引物进行PCR反应 3）电泳PCR产物 4）检查是否有PCR产物 5）PCR产物的长度是否与外源基因一致 原理图p58
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2. Southern blot杂交 原理：
从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用特 异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只 有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在 底片上曝光显示。
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选择过程
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-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
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3. 营养缺陷型筛选法 原理 载体能够合成某些生长必须营养成分， 受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。 在缺少该营养物质的培养板上涂布细菌，长出的菌落 均含有载体的，是否重组子需进行第二轮筛选。
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选择过程
营养合成型载体
营养缺陷型受体
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待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
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方法： 固定样品 一抗结合 二抗结合 显色/发光反应 比色
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2. 放射免疫原位检测 原理： 蛋白——蛋白杂交
利用抗体作为“探针”原位检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。
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选择过程
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4. 噬菌斑筛选法 原理 以λ-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受 体，转化子在培养板上形成噬菌斑。 取代型载体，噬菌斑即为重组子； 插入型载体需进行二次选择
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选择过程
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基于克隆片段序列的筛选与鉴定
1. PCR鉴定法 原理： 针对已知目的片段特异性扩增。包括：区分重组 子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目 的片段是否整合在受体基因组上。 PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。
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无环丝氨酸培养基
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（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
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2. -半乳糖苷酶显色反应筛选法
乳糖
半乳糖 +-半乳糖源自酶X-gal半乳糖 +
原理
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基 端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完 整有功能的-半乳糖苷酶。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
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②酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理： 一抗（primary antibody）：与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linked）二抗： 携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶， 再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推 测目标分子的含量。
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选择过程 SDS-PAGE，染色
不适于筛选
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5.转译筛选法 原理：
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克 隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符 合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。
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选择过程 载体+外源DNA 转录
mRNA 无细胞翻译系统
翻译 35S标记的肽链
35S标记的 甲硫氨酸
3. western blotting 原理： 蛋白——蛋白杂交 选择过程 western blot过程
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单抗blotting结果
多抗Blotting结果
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4. 蛋白凝胶电泳 原理： 待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳 结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受 体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。
第5章 基因工程基本流程 ——筛选与鉴定
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
1. 抗药性筛选法 原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
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3
4
pBR322抗生素标记选择 （1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin） （蓝灰色）褪色。
分子量 Marker28
重组 克隆
载体
7. 限制性酶切图谱法 限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用 电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。
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原理： 在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择 一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果(DNA条 带数目和分子大小）差异进行区分。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片 断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。
针对表达载体的检测方法
1. 蛋白质功能检测 原理：
外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根 据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应 的检测方案
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固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
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缺点：需要电镜
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5. Northern blotting 原理：
从宿主细胞中提取RNA， 再用探针杂交。 主要检测插入片断是否 被转录。检测表达载体。
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选择过程 Northern blot流程
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6. 直接电泳检测 原理：
有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大
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选择过程
从转化后的 菌体克隆中 分离质粒， 电泳、比较 其分子量。
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选择过程 Southern blot流程
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3. 菌落/噬菌斑原位杂交 原理：
特异性探针（与目的基因同源）进行的核酸原位杂交
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选择过程
探针的制备及标记，p60
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4. R-环检测法 原理： DNA-RNA杂交： 外源基因的mRNA与重组载体杂交
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选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性 的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA 双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
PAGE电泳
与预期的产物分 比较放射性
子量相符？
带纹的位置
放射自显影
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6. DNA-蛋白质相互作用筛选 检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 ChIP 、EMSA、甲基化干扰实验……
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一般克隆与筛选策略
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一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
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选择过程
1) 弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌 株的突变型缺陷。
受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的培 养基中生长
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2) 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
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选择过程
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性 基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养 基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨 酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而 被环丝氨酸杀死。
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A
B
A或B
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不同克隆的酶切结果
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选择过程
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
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8. DNA序列测定 原理：
通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子
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选择过程 双脱氧末端终止法 化学降解法 焦磷酸降解法 高通量Solexa测序 ……
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基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
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3) 酶活性检测 针对外源基因表达产物是酶。
①扩散免疫沉淀检测分泌型产物
原理：抗原——抗体凝集反应 方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当 插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。