WB实验原理
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
WB实验原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。
Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。
原理1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。
在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。
因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。
2．Western 印迹在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。
随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。
最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。
Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。
方法1.样品的制备从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WB原理及操作注意事项详解解读
• 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而 后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维 素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后 人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分 析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对 单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹 法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分 子的印迹分析称为Eastern印迹法。
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
WB原理及操作注意事项详解解读
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
优化转移过程
• 调节转移缓冲液成分： SDS（<0.05%） 甲醇（10%-20%小分子除外） • 延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除 凝胶中的SDS） 5-30min
• In SDS-PAGE systems, the running buffer is supplemented with SDS. This SDS concentrates from the cathode reservoir and runs into the gel behind the bromophenol blue tracking dye. Since most gels are run until the tracking dye is at the bottom of the gel, all of the excess SDS remains in the gel and is carried over into the blotting procedure. If it isn’t allowed to diffuse out of the gel prior to transfer, it will interfere with protein adsorption. Equilibration times can be extended up to 30 minutes, and sufficient buffer should be used to reduce the SDS to a minimal level.
wb实验大分子转膜电流电压
wb实验大分子转膜电流电压摘要：1.实验背景及目的2.实验原理3.实验过程4.实验结果与分析5.实验结论正文：1.实验背景及目的近年来，大分子转膜电流电压在生物学领域受到广泛关注，该现象涉及到生物膜通透性以及生物分子在膜中的传输过程。
本实验旨在通过实验手段探究大分子转膜电流电压的现象及其规律。
2.实验原理大分子转膜电流电压是指在电场作用下，大分子通过生物膜的传输过程。
该过程受到膜的物理性质、大分子的性质以及溶液环境的影响。
通过测量不同条件下的电流电压，可以了解大分子转膜的规律。
3.实验过程实验分为以下几个步骤：（1）准备实验材料：包括大分子溶液、缓冲液、电极等。
（2）组装实验装置：将电极浸泡在缓冲液中，连接电路。
（3）进行实验：将大分子溶液倒入实验装置，记录电流电压变化。
（4）改变实验条件：分别在不同浓度、不同温度、不同pH 值下进行实验，记录电流电压变化。
（5）数据处理：对实验数据进行统计分析，绘制图表。
4.实验结果与分析实验结果显示，在不同条件下，大分子转膜电流电压表现出不同的特点。
在一定范围内，随着大分子浓度的增加，电流电压呈上升趋势；随着温度的升高，电流电压也呈上升趋势；而在不同pH 值下，电流电压的变化不大。
通过数据分析，可以得出以下结论：（1）大分子浓度和温度对转膜电流电压有显著影响；（2）pH 值对转膜电流电压的影响较小。
5.实验结论本实验通过对大分子转膜电流电压的探究，发现大分子浓度和温度是影响转膜电流电压的主要因素。
在实际应用中，可以通过调控这些因素来优化大分子的转膜过程。
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）Western Blot 实验原理WB 是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot 分类根据显⾊⽅法主要有以下⼏种：1. 放射⾃显影2. 底物化学发光 ECL3. 底物荧光 ECF4. 底物 DAB 呈⾊现在常⽤的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈⾊，体同⽔平和实验条件的是⽤第⼀种⽅法，⽬前发表⽂章通常是⽤底物化学发光 ECL。
只要买现成的试剂盒就⾏，操作也⽐较简单，原理如下（⼆抗⽤ HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁⽶诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶⽚曝光，就可洗出条带。
实验常见的问题指南01参考书推荐A. 对初学者看什么资料⽐较好？解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。
02针对样品的常见问题此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【阅读原⽂】查看。
B. 做线粒体膜 UCP2 蛋⽩的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋⽩酶抑制剂），⽤的博⼠德的⼀抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 µg，换了个 santa cloz 的⼀抗仍不⾏。
是什么原因？蛋⽩酶抑制剂单加 PMSF ⾏吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋⽩酶抑制剂。
同时，建议检查 Western Blot 过程，提⾼⼀抗浓度。
对于加蛋⽩酶抑制剂来说，⼀般加 PMSF 就可以了，最好能多加⼏中种蛋⽩酶抑制剂。
C. 细胞⽔平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋⽩够 Western Blot？解答：⼀般地 5* 106 就⾜够了。
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。
Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。
原理1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。
在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。
因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。
2．Western 印迹在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。
随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。
最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。
Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。
方法1.样品的制备从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。
可根据不同的目的采用不同的方法。
如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。
1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品1）裂解细胞或组织a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体，加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。
b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。
c.动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，然后加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后，用于步骤2）。
2）将样品置于沸水浴中加热10分钟。
3）室温下以10000rpm将样品离心10分钟，将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。
1.2裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种，在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下，一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液，然后逐步过渡到更专门的提取方法。
三去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，0.1% SDS，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40，0.5% 去氧胆酸钠单去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40或Triton X-100。
高盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0），500mmol/L NaCl， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。
无盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0）， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。
1）裂解细胞或组织a.单层培养细胞：用冷PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃取洗液并吸尽残余的PBS液体，加入一定体积（50～200μl）用冰预冷的裂解缓冲液，置于冰上孵育20分钟。
然后用细胞刮刀将细胞刮下，连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中，用于步骤2）。
b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，重悬细胞，于冰上放置30分钟后，用于步骤2）。
d.动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，用于步骤2）。
2）于4℃以12000rpm将裂解物离心2分钟。
3）将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。
电泳时取出适量的提取液（50μg）与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性。
2．蛋白含量的测定（Bradford）2.1 所需试剂1）0.15mol/L NaCl： NaCl 0.88g水 100ml2）0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.5mg0.15mol/L NaCl 1ml3）考马斯亮蓝溶液：在1L容量瓶中，将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml磷酸，然后补加水至容量瓶体积。
用滤纸过滤后，于4℃保存。
2.2 操作步骤1）分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml BSA（ 1.0，2.5，5.0，10和20μl），以0.15mol/L NaCl补足体积至20μl，同时以两管20μl的0.15mol/L NaCl作空白对照。
2）每管各加入480μl考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。
3）用1cm光径的比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。
4）取待测样品2.5μl，补加0.15mol/L NaCl 17.5μl，480μl考马斯亮蓝溶液，混匀后，在A595下比色，从BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白含量。
如果待测样品的浓度过高，可稀释后再测。
3．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 印迹3.1 所需试剂1）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29gN，N′-亚甲双丙烯酰胺 1g水 100ml2）10% SDS： SDS 10g水 100ml3） 1.5mol/L Tris（pH 8.8）：Tris 18.17g水 80ml溶解后，用浓HCl调pH至8.8，补水至100ml，4℃保存。
4）10% 过硫酸铵：过硫酸铵 0.1g水 1ml4℃保存可使用一周。
5） 1.0 mol/L Tris（pH 6.8）：Tris 12.11g水 80ml溶解后，用浓HCl调pH至6.8，补水至100ml，4℃保存。
6）Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸， 0.1% SDS）： Tris 3.02g甘氨酸 18.8g10% SDS 10ml水至 1000ml7）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶所需溶液：水 3.3ml30%丙烯酰胺溶液 4.0ml1.5mol/L Tris（pH 8.8）2.5ml10% SDS 0.1ml10% 过硫酸铵 0.1mlTEMED 0.004ml8）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所需溶液：水 3.4ml30%丙烯酰胺溶液 0.83ml1.0 mol/L Tris（pH 6.8） 0.63ml10% SDS 0.05ml10% 过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.005ml9）甲醇：冰醋酸固定液：甲醇 450ml冰醋酸 450ml水 100ml10）0.25% 考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.25g甲醇：冰醋酸固定液 100ml11）转移缓冲液（48 mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037% SDS，20% 甲醇）： Tris 5.8g甘氨酸 2.9g10% SDS 3.7ml甲醇 200ml水至 1000ml12）丽春红储存液：丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g水至 100ml 使用时，用水稀释10倍。
13）封闭液[10mmol/L Tris.Cl（pH 7.5），150mmol/L NaCl，2% Tween 20，4% BSA]： 1mol/L Tris.Cl（pH 7.5） 1ml1mol/L NaCl 15ml20% Tween 20 10ml牛血清白蛋白（BSA） 4g水至 100ml14）洗涤缓冲液[10mmol/L Tris.Cl（pH 7.5），150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20]： 1mol/L Tris.Cl（pH 7.5） 1ml1mol/L NaCl 15ml20% Tween 20 0.25ml水至 100ml15）抗体稀释液：BSA 0.4g 洗涤缓冲液 100ml分装后，-20℃冻存。
16）ECL检测试剂盒：北京普利莱公司产品。
3.2操作步骤：3.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1）根据厂家说明书安装好垂直板电泳槽的玻璃板。
2）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶溶液。
3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1厘米）。
用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层水，以防止空气中的氧进入凝胶而抑制聚合反应。
将凝胶垂直放置于室温下聚合。
4）分离胶聚合完全后，倾去覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。
尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。
5）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶溶液。
6）在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。
小心避免混入气泡，再补充一些积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。