栽培菘蓝居群的遗传多样性分析

栽培菘蓝居群的遗传多样性分析摘要：试验以不同地理区域中药种植上所用的菘蓝栽培居群为材料，通过对与菘蓝药用有关的植物学性状指标（株高、叶面积、叶干重、根干重）的遗传多样性指数统计、主要药用有效成分（靛蓝、靛玉红）的含量测定、酯酶等位酶酶谱的建立与聚类分析，计算了用于衡量菘蓝居群内变异水平的多态位点比率、有效等位基因数、观察杂合度3个指标，探讨了常见的栽培菘蓝各居群之间的遗传多样性关系，以揭示菘蓝在形态、主效成分及同工酶3个层次上的遗传多样性变化。

结果表明，河北安国（s1）、安徽亳州（s2）和河南新乡（s3）3个居群的植物学性状指标的平均遗传多样性指数分别为0.870、0.877、0.763，各植物学性状的遗传多样性指数在各居群内从高到低的排序多数为株高、叶面积、叶干重、根干重；3个居群在表型上居群间的差异不显著（p>0.05），而居群内多样性丰富。

s1的靛蓝和靛玉红的含量分别为5.67、10.93 mg/g，s2的分别为4.74、9.68 mg/g，s3的分别为5.32、9.27 mg/g，2种成分的含量分别具极显著差异水平（p1.3.3 酯酶等位酶的提取和电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳参照杨靖等[12]的方法并有所改进。

从菘蓝s1、s2和s3群体中随机分别采集30个样品的叶片，共90个样品，先用自来水冲洗干净，再用去离子水漂洗后晾干水分，每样称重0.5 g，按样品∶提取液=1∶2（w/v）的比例加提取液（1.5 mol/l、ph 8.3的tris-hcl加2% β-巯基乙醇），即1 ml，然后在冰浴条件下研磨，匀浆；接着12 000 r/min离心10 min，取上清液放入冰箱保存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶浓度为5.6%，浓缩胶浓度为3.0%。

点样孔为10泳道，每样品按40 μl的点样量点样2泳道，从左到右按顺序依次进行点样。

在4 ℃冰箱中进行电泳，电泳采取稳压方式，浓缩胶电压150 v，分离胶电压350 v，整个电泳过程约需4～5 h。

酯酶等位酶采用α-醋酸萘酯加β-醋酸萘酯加固蓝rr盐溶液复合染色，染色时间3 min左右，待显现条带后立即取出（由于取出后凝胶上仍附着有染液，且染色速度极快，并且在转移至漂洗的过程中还在继续染色，故不必等条带彻底显现才取出，否则会造成条带过宽而重叠，统计时损失条带），染色完毕后，用清水漂洗3～5遍即可。

对胶板进行照相，统计条带并记录。

1.4 数据分析1.4.1 植物学性状数据分析菘蓝的株高、叶面积、叶干重和根干重4个数量性状参考丁艳来等[13]的方法进行分级，以平均数（x）为基准，0.25s为级差（s为标准差），最小级为小于x-2s，最大级为大于x +2s，用分级数据计算遗传多样性指数（以simpson指数[14]h为指标，h=1-■pi2，其中pi为某个级别出现的频率，n为级别总数），并采用spss 13.0统计软件对植物学性状进行方差分析。

1.4.2 酯酶等位酶图谱和聚类分析统计电泳条带并计算用于衡量居群内变异水平的3个指标[8]，分别为：①多态位点比率（percentage of polymorphic loci，p），p=（多态位点数/检测位点总数）×100%；②平均有效等位基因数（mean effective numberof alleles per locus，ae），ae=各位点有效等位基因总和/检测位点总数；③观察杂合度（mean observed heterozygosity per locus，ho），ho=杂合体个体数/样本大小。

并且根据电泳条带将每个迁移率位点上条带的有、无分别用1和0表示，建立90个样品的酯酶等位酶酶谱，随机取其中10个样品做代表性分析。

再根据文献[15]的方法计算相似系数，建立相似矩阵，采用ntsyspc-2.10 e程序[16]，以非加权成对数据分析法（unweighted pair-group method with arithmetic means，upgma）将90个样品经聚类分析按照nei’s遗传距离理论生成系统树。

2 结果与分析2.1 3个菘蓝居群植物学性状的多样性3个菘蓝居群株高、叶面积、叶干重和根干重4个植物学性状指标的测定结果（均值）见表1，分别对这4个性状进行单因素方差分析，其中株高方差分析的结果见表2，而叶面积、叶干重和根干重3个性状的方差分析结果与株高类似，故略去，而以株高方差分析的结果代表之。

3个菘蓝居群4个植物学性状指标的多样性分析结果见表3。

从表2、表3可见，4个性状在3个菘蓝居群间没有显著性差异。

然而在居群内表现出较高的多样性，如株高平均为74.05 cm、变幅为45.6～86.9 cm、变异系数为12.8%；叶面积平均为76.06 cm2、变幅为62.49～88.62 cm2、变异系数为9.4%；叶干重平均为0.89 g、变幅为0.65～1.09 g、变异系数为8.1%；根干重平均为5.58 g、变幅为4.53～6.87 g、变异系数为9.7%。

另外，株高与叶面积、叶干重、根干重都没有明显的相关性，而叶面积和叶干重有显著的正相关性（r=0.90）。

由表1、表2和表3可见，栽培用的菘蓝种质资源不具备明显的品种特征，根据田间植株的外部特征难以区分居群之间的差异。

从表3还可见，综合3个菘蓝居群的株高、叶面积、叶干重和根干重4个植物学性状指标，其simpson指数平均为0.912，河北安国、安徽亳州和河南新乡3个居群的平均simpson指数分别为0.870、0.877和0.763。

总体上表现出较高的遗传多样性，其中在各居群内部表现出相同的规律性，simpson指数从高到低的排序多数为株高、叶面积、叶干重、根干重。

2.2 靛蓝和靛玉红的含量靛蓝和靛玉红的吸收光谱测定结果见图1，根据图1，靛蓝和靛玉红的最大吸收波长分别为609 nm和540 nm。

以氯仿做空白样，分别在609 nm和540 nm处测定靛蓝、靛玉红标准溶液的吸光度。

根据lambert-beer定律：a=e·c（a表示吸光度，e表示消光系数，c表示溶液的浓度），分别计算出4个消光系数。

当波长为609 nm 时，e609靛蓝=27.03，e609靛玉红=4.82；当波长为540 nm时，e540靛蓝=12.34，e540靛玉红=15.47。

靛蓝、靛玉红含量的计算公式分别为：c靛蓝=4.31×10-2×a609-1.34×10-2×a540；c靛玉红=7.53×10-2×a540-3.43×10-2×a609。

式中： c靛蓝为靛蓝在待测溶液中的质量浓度（mg/ml），c靛玉红为靛玉红在待测溶液中的质量浓度（mg/ml），a609为待测溶液在波长609 nm处的吸光度值，a540为待测溶液在波长540 nm处的吸光度值。

经测定，靛蓝和靛玉红在4 ℃下可放置24 h，精密度（相对标准偏差，rsd）分别为2.86%和2.94%。

3个菘蓝居群的靛蓝和靛玉红的含量测定结果见表4，单因素方差分析结果[f靛蓝=13.86，f靛玉红=15.08；f0.01（2，6）= 10.92]显示，3个菘蓝居群中的靛蓝和靛玉红含量都达到极显著差异水平。

2.3 等位酶酶谱分析参照王中仁[17]的方法，对90个不同种质来源的菘蓝样品进行酯酶等位酶酶谱分析，随机取其中10个菘蓝样品做代表性分析，结果见图2。

通过酯酶等位酶酶谱分析，确定了5个酯酶等位酶基因位点，即est-1、est-2、est-3、est-4、est-5，其中est-1为慢速带，est-2和est-3为中速带，est-4和est-5为快速带；在90个随机样品中共获得了13条est带，分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m，其中est-2 的d带、est-3的h和i带、est-4 的k带以及est-5的m带为90个随机样品的共有谱带；其有效等位基因数、多态位点比率、观察杂合度分别是1.346 9、61.53 %、0.346 9；其中遗传多样性最丰富的是s1居群，其平均有效等位基因数、多态位点比率、观察杂合度分别是1.432 6、69.23%、0.432 6，说明s1居群的种质来源要比s2和s3居群更为广泛，是试验取材与品种选育的良好资源。

2.4 聚类分析采用ntsyspc-2.10 e程序、以非加权成对数据分析法将不同种质来源的3个菘蓝居群的共90个被测样品的酯酶等位酶酶谱条带数经聚类分析生成系统树，结果见图3。

从图3可见，90个样品在相似系数0.70处可聚为3类，可明显地分为3组；第ⅰ聚群包含有66个样品，占总样品数的73%；第ⅱ聚群包含有10个样品，占总样品数的11%；第ⅲ聚群包含有14个样品，占总样品数的16%。

其中第ⅰ聚群的66个样品来自于s1、s2、s3居群的数目分别是17、24、25，第ⅱ聚群的10个样品来自于s1、s2、s3居群的数目分别是3、3、4；第ⅲ聚群的14个样品来自于s1、s2、s3居群的数目分别是10、3、1。

由此可见，3个居群并没有体现出明显的地理位置特征，但是反映出居群s1较s2、s3具有更丰富的遗传多样性这一特征，聚类结果与酯酶等位酶酶谱的居群内产生变异的有效等位基因数、多态位点比率、观察杂合度3个指标所显示的结果一致，也和植物学性状的simpson多样性指数结果较为接近；居群s2和s3的遗传多样性虽然不及居群s1，但展示出了这2个居群作为栽培种的整齐性和相似性优势，这也跟酯酶等位酶酶谱与植物学性状的遗传多样性分析结果较为一致。

3 讨论3.1 植物学性状和酯酶等位酶分析在研究菘蓝遗传多样性中的作用遗传多样性（或基因多样性）是生物多样性的3个基本组织层次之一[18]，其可以从“形态”、“细胞”和“分子”等不同水平上切入研究，其中等位酶分析可以在大多数情况下作为遗传标记来反映整个基因组的遗传变异情况[17]。

在形态水平方面，刘新龙等[19]采用株高等表型性状对甘蔗（saccharum l.）种质资源进行了遗传多样性分析；丁艳来等[13]结合表型性状和ssr分子标记对中国野生大豆（glycine soja sieb. et zucc.）做了遗传多样性分析；而在单一分子水平方面，已经有等位酶和基于基因组的各种分子标记对遗传多样性进行了分析，前者在文中已有提及，后者的相关研究举不胜举，这里不再赘述。

由于菘蓝个备良好的药用功效以及人们保健意识的增强，使菘蓝药材的需求量日趋增大，然而各地区由于地理环境及栽培管理方式的不同，导致药材在产量和质量上存在较大的差异[20]。

这其中还与目前国内外缺乏一种专门用于药用植物品种选育的理论或方法[21]有关。