β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化毕业论文

1.4.1
细菌β-半乳糖苷酶，尤其是嗜热细菌产生的酶正得到广泛的研究，到目前为止，大肠杆菌（Escherichia coli）产生的β-半乳糖苷酶是研究的最彻底、最深入，并已大量用于生化分析中。细菌产生的β-半乳糖苷酶是胞内酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，它的耐热性较高，这一点有利于固定化酶的制造。但因产量低及可能的毒性问题，故迄今未用于工业化生产。
1.4.2
酵母菌产生的β-半乳糖苷酶通常是胞内酶，制备纯品必须破碎细胞，该酶对酸、热较不稳定，当某些离子存在时，才有最大活性，因此不适于在工业上进行应用。但是，酵母菌容易培养，在深层培养条件下可以大量生产β-半乳糖苷酶，这些优点掩盖了它的不足，故酵母菌产生的β-半乳糖苷酶才得以成功的进行开发。酵母菌产生的β-半乳糖苷酶最适pH近于中性，与牛乳的天然pH值接近，最适温度较低，适于处理牛乳和甜乳清中的乳糖。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生产β-半乳糖苷酶的主要酵母菌种。
关键词：β-半乳糖苷酶酶活性酶的固定化
Absract
A strain isolated from soil in producing β-galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and β-galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH β-galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37℃, enzyme high stability, 4h after the relative activity can be maintained above 85%; Mg2+on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmol/L, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+(1mmol/L) can inactivate the enzyme.
摘要
从土壤中筛选出一株产β-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的β-半乳糖苷酶进行了测定。单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的β-半乳糖苷酶的最适pH是6.5，最适生长温度为37℃，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmol/L时，酶活力可达112.24％，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmol/L）就可使酶失活。
1.3
历史上，β-半乳糖苷酶的研究为微生物学的发展作出了巨大贡献。国外对β-半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在β-半乳糖苷酶在食品加工中的应用。1889年，荷兰生物学家Beijerincek第一次报道了β-半乳糖苷酶可水解乳糖。1944年Whitter[1]就比较全面的讨论了β-半乳糖苷酶的应用。1948年Caputto[2]等讨论了通过大量培养和纯化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生产β-半乳糖苷酶的方法。法国的雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）[3]通过对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的研究，于1961年提出了乳糖操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，使酶的生物合成可以按人们的意志加以调控，为研究其他生物的代谢调控提供了依据。1972年Rorglun等报道了真菌β-半乳糖苷酶的特性。进入80年代，Jrodon等[4]首次对小鼠成功的获得了动物基因转移，是纯合子动物分泌的乳汁中完全不含乳糖，为利用基因工程生产低乳糖牛乳奠定了基础。
采用筛选出的菌种进行酸奶加工，验证其加工性能，掌握其工艺加工性能和应用于乳品加工的潜力，从而将其应用于乳品发酵产品，降低乳糖含量，缓解人体普遍存在的乳糖不耐症，扩大乳品的消费量。
具有较高β-半乳糖苷酶活性的乳酸菌能将牛奶中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这对于乳品行业的发展具有很大的应用潜力。此外，β-半乳糖苷酶可被加工成液态、药剂或粉末状形式的产品，用来治疗乳糖不耐症。这些都为产β-半乳糖苷酶的开发利用提供了潜在的发展市场。
Keyword: β-galactosidase, enzymes activity, Immobilization of enzyme
第1章绪论
1.1研究背景
β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），全名为β-D-半乳糖苷水解酶（β-D-galactoside- galcagalcato-hydrolase，EC.3.2.1.23），常简称为乳糖酶。一般说来，该酶有两种催化性质：一是催化水解反应，将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖；二是催化转移反应，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1~4个半乳糖，生成低聚半乳糖(galactooligosaccharide,GOS)；在乳糖水解产物半乳糖一侧连接果糖，生成乳果糖（lactulose）。
随着研究的不断深入，微生物发酵法生产的β-半乳糖苷酶活性会进一步得到提高。如果在国内能够实现β-半乳糖苷酶的工业化生产，其制品的生产和应用成本将会大幅度降低。因此，β-半乳糖苷酶具有广阔的市场前景，并且会取得相当可观的酶存在于植物（尤其是杏、桃、苹果），细菌（大肠杆菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母等），放线菌以及哺乳动物（特别是婴儿）的肠道中。目前仅来源于微生物的β-半乳糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶的性质有所不同[6]。
1.4.3
霉菌产生的β-半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固态培养也可以采用液态深层培养来生产，在培养过程中酶分泌到培养基中，提取较为方便。霉菌产生的β-半乳糖苷酶较耐热、耐酸，不需要活化剂和稳定剂，稳定性较高。M.S.Palunbo等人发现，米曲霉产生的β-半乳糖苷酶即使在45℃高温下贮藏6个月，仍能保存其活力的93.4%。曲霉β-半乳糖苷酶的最适pH值较低，适用于面包的制造以及分解面团中的乳糖，有利于酵母发酵，并使制品具有良好的色泽。同时，由于它较为稳定，有很好的耐受性，比酵母β-半乳糖苷酶更适合于固定化酶的制造。目前应用较多的霉菌β-半乳糖苷酶产生菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzse）和黑曲霉（Aspergillus niger）。
国内对β-半乳糖苷酶的研究起步较晚，是在20世纪80年代以后开始的。1980年天津工业微生物研究所[5]组成β-半乳糖苷酶研究组，对β-半乳糖苷酶产生菌的选育、发酵工艺研究、酶的提取纯化、酶学特性的进行了较为全面的研究。1990年无锡轻工业大学的李强军等选育到黑曲霉菌CWL2NU-3，经发酵条件优化后产酶活力达12u/ml（ONPG单位）。1985年东北农业大学的万贤生对β-半乳糖苷酶在乳清中的综合利用展开了研究。上海复旦大学的郭杰炎等以乳酸酵母Y12-1发酵生产的β-半乳糖苷酶活力达40u/ml（ONPG单位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活残存98%。
本实验还进行了β-半乳糖苷酶的固定化实验。以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。结果表明，4％的海藻酸钠，在温度37℃、pH6~7、氯化钙浓度1％、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。
The experiments were also β-galactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. Theeffects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The resultsshow that the high recovery rate of immobilized enzyme could be obtained under the conditions of 0.1% glutaraldegyde, 4% sodium alginate and 37℃temperature.
1.2
β-半乳糖苷酶可以有效降低乳制品中乳糖含量。在酸奶发酵中，向牛奶中接种保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）进行发酵，可分解掉牛乳中25~50%的乳糖，使牛奶中乳糖含量降至约4%。乳酸菌定植于肠道内，它们仍能代谢被摄入人体内的乳糖。因此，乳酸菌可以广泛用于各种乳品加工生产低乳糖制品。
目前，β-半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和开发，以满足乳糖不耐症患者对乳制品消费的需求。工业生产上最直接、有效的方法就是将酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，该法水解条件温和（pH3.8~8，温度50~60℃），产物简单，不会破坏乳中的其他营养成分。国外已有一些大公司生产商业用乳糖酶制剂，用于生产乳糖水解乳制品。