WB工艺注意事项

WB原理及操作注意事项详解解读

WB原理及操作注意事项
• 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly

WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查

WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。

wb注意事项

1.配胶用的AP要新鲜，最好现用现配。

方法是0.1g过硫酸铵，加1ml水。

2.用异丙醇压平胶面之后要用清水洗几次，确保没有大量异丙醇残留。

建议用水压面。

3.要调整TEMED用量，防止胶凝得过快，凝的过快不利于凝胶均匀聚合。

配置的胶必须混合均匀。

4.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE 的分离胶(即下层胶)。

SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围:6%胶 57-212kD8%胶 36-94kD10%胶 20-80kD12%胶 12-60kD15%胶 10-43kD5.如果浓缩胶跑的好的话，几个孔的蛋白会跑成一条直线。

注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液6.电泳结束时候蛋白条带会扩散，防治扩散的溶液是：40%无离子水 10%乙酸 50%甲醇，即40ml蒸馏水，10ml乙酸，50ml甲醇。

7.转膜：滤纸不要过大，防止形成短路。

8.PVDF膜先用甲醇泡几分钟，目的是为了增强膜的正电荷。

甲醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。

9.A ll proteins are hindered from binding to membranes bySDS but small proteins more so than large proteins. If your protein of interest is small, consider removing SDS from the transfer buffer.10.对于小分子量蛋白(<100 kD)SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。

如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。

保持甲醇的浓度在20%一般在转大分子量蛋白时电转液里加入0.1%SDS 是为了增加转印效率，在转小分子时可以不用；另外，转小分子时电转液里的甲醇浓度最好提高到15-20%。

WB注意这些问题，新手也能做出满意结果

WB注意这些问题，新手也能做出满意结果Western Bolt实用小细节Western blot（WB）是检测蛋白质及蛋白质翻译后修饰的经典方法，可在简单或复杂的生物样品中提供有关靶蛋白的半定量或定量数据。

WB步骤复杂，通常包括：蛋白样本制备→电泳→转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→显影→分析。

WB任何过程出现Bug均可影响结果的重复性与灵敏度，因此必须注意将WB的每个步骤标准化。

今天给大家分享WB各个过程中需要注意的细节！1样品制备有效的样品制备是影响WB可重复性的非常重要的因素。

需考虑以下问题：1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，细胞质/膜蛋白？2、溶解的蛋白或其翻译后修饰的维持是否需要添加额外的缓冲成分(例如洗涤剂、酶抑制剂)？3、蛋白质定量的方法是什么，缓冲成分会干扰蛋白定量吗？BCA 蛋白定量检测法是总蛋白质定量的常用方法，其蛋白间差异较考马斯染料法的更小，但与还原剂、螯合剂不兼容（兼容去垢剂）。

2电泳1、最合适的凝胶浓度是什么？不同分子量的蛋白分离胶浓度对应表：2、哪种电泳缓冲液最合适？例如，3-(N-吗啡啉）丙磺酸缓冲液（MOPS缓冲液）适合~75KDa的蛋白质，2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)适合<36KDa的蛋白质。

3、电泳多长时间和以及电泳条件？4、蛋白质的分子量迁移情况如何？蛋白质的分子量迁移因凝胶类型、浓度和电泳缓冲液的不同而不同。

对应情况如下：3转膜1、什么是最合适的膜？例如，PVDF膜或NC膜（0.45μm）。

PVDF膜有两种规格，0.45μm的膜适用于检测大于20KDa的蛋白质，0.2μm膜适用于小于20的蛋白质。

PVDF需要在甲醇中浸泡1-2min 激活。

不同分子量蛋白转膜条件：大于150KDa蛋白可恒压20V 4度湿转过夜。

2、转膜液甲醇浓度如何？小分子量蛋白的转膜需要注意：（1）高浓度的凝胶有利于小分子量蛋白的分离。

一般在目的蛋白离凝胶前沿0.5-1cm时停止电泳，太靠近凝胶前沿易引起边缘效应。

Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查

Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。

因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

大分子量蛋白 western注意事项

大分子量蛋白 western注意事项在进行大分子量蛋白 Western 检测时，需要注意以下几点：1. 蛋白提取：确保使用适当的蛋白提取方法，以获得高质量的蛋白质样品。

对于大分子量蛋白，可能需要使用更剧烈的裂解条件或添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解。

2. 电泳条件：选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以确保大分子量蛋白能够有效分离。

通常，使用较低的凝胶浓度可以更好地分离大分子量蛋白。

3. 转膜：选择合适的转膜方法和条件，以确保大分子量蛋白能够成功转移到膜上。

常用的转膜方法包括半干转印和湿转印，对于大分子量蛋白，可能需要延长转膜时间或使用低分子量滤纸来增加转移效率。

4. 封闭：选择适当的封闭液和封闭时间，以减少非特异性结合。

对于大分子量蛋白，可能需要使用更长的封闭时间或更浓稠的封闭液来减少背景。

5. 抗体选择：选择针对大分子量蛋白的特异性抗体，并确保抗体的质量和特异性。

对于大分子量蛋白，可能需要使用更高质量的抗体或进行抗体浓度的优化。

6. 检测方法：根据抗体的特性选择合适的检测方法，如化学发光、荧光或显色法。

对于大分子量蛋白，可能需要使用更敏感的检测方法来确保检测的准确性。

7. 膜的处理：在孵育抗体和检测之前，确保膜的充分洗涤，以去除未结合的抗体和杂质。

对于大分子量蛋白，可能需要增加洗涤次数或使用更严格的洗涤条件。

8. 数据分析：在分析 Western 结果时，要考虑到大分子量蛋白可能存在的多态性、截断或降解等因素。

对于异常结果，要进行适当的验证和排除。

总之，对于大分子量蛋白的 Western 检测，需要特别注意蛋白提取、电泳、转膜、封闭、抗体选择、检测方法和膜的处理等方面，以确保获得准确可靠的结果。

小分子蛋白wb注意事项

小分子蛋白wb注意事项以小分子蛋白WB注意事项为标题，我们来讨论一下在进行小分子蛋白Western Blot（简称WB）实验时需要注意的事项。

一、实验前的准备工作在进行小分子蛋白WB实验之前，我们需要做一些准备工作，以确保实验的顺利进行。

首先，我们需要准备好实验所需的试剂和仪器设备。

这包括蛋白提取液、蛋白浓度检测试剂盒、凝胶电泳设备、转移膜等。

同时，我们还需要准备好实验所需的动物组织样本或细胞培养物。

二、蛋白提取与浓度检测在进行小分子蛋白WB实验之前，我们需要从组织样本或细胞中提取蛋白。

蛋白提取的方法有多种，如RIPA缓冲液法、细胞裂解液法等。

提取蛋白后，我们需要使用蛋白浓度检测试剂盒来确定蛋白的浓度，以便后续的凝胶电泳和转膜步骤。

三、凝胶电泳凝胶电泳是分离蛋白的常用方法，可以根据蛋白的大小和电荷来进行分离。

在进行凝胶电泳时，我们需要根据实验的需要选择合适的凝胶类型和浓度。

同时，我们还需要准备好电泳缓冲液，并根据实验的需求进行电泳条件的设置。

四、转膜转膜是将凝胶中分离的蛋白转移到转移膜上的过程。

在进行转膜之前，我们需要准备好转膜装置，并将其装配好。

在进行转膜时，我们需要注意转膜膜的选择，如聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）。

转膜的条件也需要根据实验的需求进行设置。

五、免疫检测在进行小分子蛋白WB实验时，我们通常会使用特异性抗体来检测目标蛋白。

在进行免疫检测之前，我们需要对抗体进行充分的验证，确保其具有良好的特异性和敏感性。

在进行免疫检测时，我们需要根据实验的需求进行合适的抗体稀释，并按照标准的免疫检测步骤进行操作。

六、结果分析在完成小分子蛋白WB实验后，我们需要对实验结果进行分析。

这包括对目标蛋白的表达水平进行定量分析，并与对照组进行比较。

同时，我们还可以进行进一步的数据统计和图像处理，以获得更准确的实验结果。

进行小分子蛋白WB实验时需要注意的事项包括实验前的准备工作、蛋白提取与浓度检测、凝胶电泳、转膜、免疫检测以及结果分析。

W-B注意事项

1．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳注意胶有剧毒（神经毒性）！！必须带手套，注意自身安全问题！！！在该实验室操作时，没带手套不要碰任何东西！！制胶模具的准备（根据厂家说明书）注意每次用完后要用洗洁精洗净，用水冲干净，模具上的脏物及洗洁精残留的SDS均会影响胶的凝固过程，影响胶的均匀性分别灌制分离胶和浓缩胶，分离胶浓度视目的蛋白的大小确定（7.5%～15 %）具体见试剂配方（分别试了12％及12.5％的分离胶两种浓度，推荐浓度为12.5％的分离胶），分离胶上样(注意是否有漏)、水封（速度要慢，防止稀释，要有枪头由一侧滑动至另一侧的动作）、静置半小时，将封闭用的水去除（剩余的水用滤纸吸干净），配浓缩胶，上梳，静置半小时，拔梳（小心，在running buffer中进行，速度要慢）观察梳形是否整齐。

蛋白样本（加蛋白样本的量根据实验所需）加入4×加样缓冲液（见配方）及水，100°C 煮5 min使蛋白完全变性，例：跑胶每个样本20ul（我们加样感觉加20ul会溢出，实验时选择加16ul），需含蛋白量80ug，80/蛋白浓度得到需要蛋白样本加样量X。

加样缓冲液（4×sample buffer）加5ul，20－5－X即为加水量。

煮沸时注意管口要封劳。

如果有条件的话用封口膜。

煮沸以后用离心机低速离心20秒左右，上样时要看清梳形，小心加样，防止交叉污染，100 V电泳30min浓缩胶，150V电泳70min分离卸胶，把你所要的部分切下来，注意在胶的长度方面宁可多切，结果分析时需要完整的条带补充：（1）在浓缩胶内先用100V电压跑胶，再用200V可以使条带更直；（2）在使用4×加样缓冲液时如天气较冷，应先用37°C水浴使其中的SDS溶解；（3）第一次使用剩下的蛋白样本在－20℃冰箱保存。

在第二次使用稀释好的蛋白样本时应同样用100°C水煮；（4）加样时每块胶应有Mark和对照，并保持对照的始终一致。