流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪
流式细胞仪什么是流式细胞仪？流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，它能够实现单细胞的快速分析、分类以及划分。
流式细胞仪的原理流式细胞仪的基本结构包括激光源、光学系统、电子学系统和计算机系统。
在样本准备完成后，激光量子将对待检测的细胞进行激励，细胞中的荧光标记物或颜料受到光的激发会发生发射，发射的光传递到光学系统后进行过滤处理后再通过相应接收器接收，传输到电子学系统和计算机进行分析和记录。
流式细胞仪在生命科学领域应用免疫细胞学免疫细胞学是流式细胞仪最广泛的应用领域。
通过对细胞表面分子的特异性检测来实现不同免疫细胞的鉴定和分类。
基于荧光标记同种或异种抗体的原理，使得负责流式细胞仪的计算机可以在短时间内分析千万级别的细胞数。
活细胞筛选通过流式细胞仪可以对生长期的细胞进行筛选，对不同阶段的细胞群体进行分离，可以实现对细胞的遗传和基因表达水平的研究。
分子生物学领域流式细胞仪在分子生物学领域中也起到关键的作用，它能够进行 DNA 浓度分析、测定蛋白质的表达量、检测RNA的表现等。
神经科学领域流式细胞仪还可以在神经科学领域发挥一定的作用，可以检测神经细胞在形态、力学、电生理性质等方面的变化。
流式细胞仪存在的不足流式细胞仪的存在也面临一些问题，例如因为激光的存在会对样本造成一定的损伤，需要非常小心地处理样本。
此外，部分实验者对于样本的操作技能要求较高，需要一定的专业知识和严格的操作规程。
总结流式细胞仪是一种非常有用的生命科学实验技术，主要应用于免疫细胞学、活细胞筛选、分子生物学以及神经科学领域等科学研究。
然而，由于激光的存在，样本操作技能的要求较高，需要仔细对待和操作。
流式细胞仪简介
流式细胞仪一、结构技术特点（4个方面）：（1）流动室和液流系统（2）激光源和光路系统（3）光电管和信号测量及计算机分析系统（4）细胞分选系统流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。
也就是说，它的细节分辨率为零。
流式细胞计的基本结构二、原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
2、用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
3、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
4、这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
5、光散射信号在前向小角度进行检测，光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；6、荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，7、经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
8、计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
9、检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分析
04
流式细胞仪的应用
在免疫学研究中的应用
免疫细胞分型
流式细胞仪可以对免疫细胞进行分型，了解不同类型免疫细胞的分布和比例，有助于研究免疫系统的功能和疾病 发生机制。
免疫细胞功能分析
通过流式细胞仪可以检测免疫细胞的活性和功能状态，例如检测T细胞和B细胞的增殖、细胞因子的分泌等，有助 于研究免疫细胞的应答机制。
光电转换和信号处理原理
光电转换
光电倍增管将荧光信号转换为电信号，以便进一步处理和分 析。
信号处理
信号处理系统对电信号进行放大、滤波和数字化处理，以便 在计算机上进行分析和显示。
03
流式细胞仪的数据分析
数据获取和预处理
数据获取
流式细胞仪通过激光照射细胞，产生 散射光和荧光信号，这些信号被光电 倍增管接收并转换为电信号，再通过 模数转换器转换为数字信号。
在肿瘤学研究中的应用
肿瘤细胞分型与鉴别
流式细胞仪可以对肿瘤细胞进行分型和鉴别，有助于肿瘤的诊断和分类。
肿瘤细胞耐药性分析
通过流式细胞仪可以检测肿瘤细胞对药物的敏感性和耐药性，有助于制定个性化的治疗方案。
在血液学研究中的应用
造血干细胞研究
流式细胞仪可以对造血干细胞进行分离 和鉴定，有助于研究造血干细胞的发育 和分化机制。Βιβλιοθήκη VS白血病分型与鉴别
流式细胞仪可以对白血病细胞进行分型和 鉴别，有助于白血病的诊断和治疗。
05
流式细胞仪的优缺点及展望
流式细胞仪的优点
高灵敏度与特异性
流式细胞仪能够检测单个细 胞，具有高灵敏度和特异性 ，可对细胞进行精确的定量 和定性分析。
快速检测
流式细胞仪采用液流式快速 检测，可以在短时间内处理 大量样本，适合高通量检测 。
流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理与使用一、定义流式细胞仪（flow cytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。
二、基本结构1.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。
鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。
2.激光源和光学系统光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。
常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。
经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。
3.光电管和检测系统荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。
通常使用光电倍增管（PMT）。
PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。
由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。
流式细胞仪中一般备有两类放大器。
一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。
另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
在免疫学测量中常使用对数放大器。
免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。
此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
临床免疫检验：流式细胞仪的基本结构OK
细胞分选
流式分选
通
电
道
荷
式
式
分
分
选
选
LOGO
流式细胞仪基本结构示意图
小
结
01
光源
02
液流系统
03
信号接收系统
04
信号处理系统
05
细胞分选器
思考题 流式细胞技术在临床检验中有何应用呢？
感谢观看
流式细胞仪的数据参数
前向散射光
侧向散射光
荧光
散射光信号：前向散射光
LOGO
前向散射光检测器
在激光束的正前方又 称小角散射
FSC信号的强弱与细 胞的体积大小成正比 检测的是细胞或其他
颗粒的表面属性
细胞大小
前向散射光示意图
散射光信号：侧向散射光
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方向 又称90°散射
SSC信号的强弱与细 胞内颗粒结构的质量 成正比，用于检测细
细胞的分选收集。
细胞分选
光源
LOGO
➢ 良好的单色性 ➢ 单向性 ➢ 发散角小
流式细胞仪中使用的光源多为氩离子激光器氩离子 激光器的激发光波长为488nm
液流系统
LOGO
流动室工作原理示意图
流式细胞仪液流系统示意图
信号接收系统
LOGO
流式细胞仪主要接收细胞的散射光信号和荧光信号 并将其转换为与散射光和荧光强度成正比的电压脉冲
流式细胞仪的基本结构
前言
20世纪80年代后期，流式细胞术开始应用于临床 目前，流式细胞术已广泛应用在微生物感染诊断、自身免疫病诊断
组织器官移植干细胞治疗、血液系统疾病诊断中。
流式细胞仪的基本结构
LOGO
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
facs流式细胞仪原理
facs流式细胞仪原理FACS流式细胞仪原理FACS（Fluorescence-activated cell sorting）流式细胞仪是一种高效的细胞分析和分选工具，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
其原理是利用激光束激发样品中的荧光标记物，通过光学系统收集并分析细胞的荧光信号，再根据设定的参数将细胞按照特定的性质进行分选。
FACS流式细胞仪由激光系统、光学系统、荧光检测系统、信号处理系统和分选系统等组成。
其中，激光系统是FACS流式细胞仪的核心部分，它能够产生高强度、单色、单向偏振的激光束，用于激发样品中的荧光标记物。
光学系统包括透镜、滤光片、反射镜等光学元件，用于收集和聚焦激光束，以及分离和收集样品中的荧光信号。
荧光检测系统由光电倍增管、滤光片和光学纤维等组成，用于检测和转换荧光信号为电信号。
信号处理系统包括模数转换器、计算机等，用于处理和分析荧光信号。
分选系统由电极、压力控制系统和收集器等组成，用于根据设定的参数将细胞按照特定的性质进行分选。
FACS流式细胞仪的原理是基于细胞的荧光标记物和荧光信号的特性进行分析和分选。
荧光标记物可以是细胞表面的抗原、细胞内的染色体、蛋白质、RNA等，它们可以被特定的荧光染料或荧光标记抗体所识别和标记。
荧光信号的强度和颜色可以反映细胞的特定性质，如表面抗原的表达、细胞周期的状态、细胞凋亡的程度等。
通过设定荧光信号的参数，如荧光强度、荧光颜色、荧光峰值等，可以将细胞按照特定的性质进行分选。
FACS流式细胞仪的应用非常广泛，它可以用于细胞表型分析、细胞功能研究、细胞凋亡检测、细胞分选等方面。
在生物医学研究中，FACS流式细胞仪可以用于研究肿瘤细胞的表型和功能、免疫细胞的分化和活化、干细胞的分选和鉴定等方面。
在临床诊断中，FACS流式细胞仪可以用于诊断血液系统疾病、免疫缺陷病、肿瘤等方面。
在药物开发中，FACS流式细胞仪可以用于筛选和评价药物的作用机制和效果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞仪主要由以下五部分构成：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统：光学系统；信号检测与存储、显示、分析系统；细胞分选系统(图4-3)。
1．流动室和液流系统是流式细胞仪的核心部件。
流动室由样品管、鞘液管和喷孔等组成。
常用石英等透明、稳定的材料制作。
样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘液包绕通过流动室内的一定孔径的孔。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞啦单行排列依次通过激光检测区。
为了保证液流速度稳定。
一般限制液流速度小于10 m／s。
流动室孔径有60 μm、100μm、150μm、250 μm等多种。
2．激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm，此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm)和(或)紫外激光管。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光
514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80％；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。
将有机染料作为激光器泵浦的一种成分，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodanline 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。
因此需将激光光束经透镜会聚。
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。
流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔的将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚
焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度地减少杂散光的干扰。
为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。
带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤片区段的光线滤除或通过。
例如使用525nm带通滤片只允许FITC发射的525nm绿光通过。
长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。
在免疫分析中常要同时探测两种咀上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μmx66μm)，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
3．光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。
光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)最为常用。
PMT的响应时间短，仅为数秒；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。
光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。
流式细胞计中一般备有两类放大器。
一类是输出信号幅度与输入信号呈线性关系，称为线性放大器。
线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量等。
另一类是对数放大器．输出信号和输人信号之间成常用对数关系。
在免疫学测量中常使用对数放大器。
因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。
4．计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。
多道分析器出来的信号再经模，数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存储于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。
计算机的存储容量较大，可存储同一细胞的6～8个参数。
存储于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。