Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力20页PPT

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靶向Akt1小干扰RNA对人喉癌细胞增殖和凋亡的影响

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１２方法．
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ALK全程管理 ppt课件

ceritinib的获得性耐药机制，目前认为包括基因突变、致癌旁路及药代动力学逃逸等，这与克唑替尼和Alectinib获得性耐药机制较为相似。
ppt课件
13
Alectinib
Alectinib，二代ALK-TKI，可透过血脑屏障，拥有极好的的CNS渗透性，其对 ALK的抑制作用高于克唑替尼约5倍，且可抑制大多数克唑替尼耐药的ALK突变。2016年JCO的II期，经一线TKI治疗的ALK重排患者应用Alectinib， ORR 为50%，中位缓解持续时间是11.2月。备受关注的是Alectinib在CNS作用：在35例基线可测量的CNS转移灶患者中，CNS ORR为57%。在23例基线存在CNS转移灶且前期未经放疗的患者中，10例（43%）达到了CNS CR。在治疗的第12个月，33名患者（24.8%）CNS进展，43名患者（33.2%）非 CNS进展，随着时间的推移，非CNS较CNS更早出现进展发生率的升高，而死亡累计发生率升高速度显著低于其他事件。提示Alectinib在治疗ALK基因重排且对克唑替尼耐药的晚期非小细胞肺癌（包括存在脑转移）效果显著且耐受性良好，有望为该类患者提供更优的治疗选择。
ALK重排晚期非小细胞肺癌的全程管理
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一、背景
✓ ALK融合基因发生于3%-7%的NSCLC患者，临床上常见于不吸烟的年轻腺癌患者，通常与EGFR或KRAS突变的发生互相排斥。
✓ 一代ALK抑制剂克唑替尼，应用于ALK重排、ROS1重排、MET 扩增和MET外显子14跳跃突变的NSCLC患者。
、
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总结
2007年发现ALK重排靶点，到目前已经获批3 个靶向药物，晚期ALK阳性NSCLC患者的OS可延长到4年多

akr1b10基因沉默对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

图1akr1b10在hcc中的表达情况24akr1b10敲减可延迟肿瘤发生降低hcc异种移植小鼠的肿瘤体积将akr1b10敲减组以及对照组的huh7细胞皮下注射到balbcnude雌性小鼠的左下肢28d后拍照并剥离瘤体如图4ab所示akr1b10敲减的hcc细胞致癌能力减弱肿瘤体积减少
７９８
临床肝胆病杂志第卷第期年月，，３６４２０２０４ＪＣｌｉｎＨｅｐａｔｏｌＶｏｌ．３６Ｎｏ．４Ａｐｒ．２０２０
：ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＡｌｄｏ－ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｆａｍｉｌｙ１ｍｅｍｂｅｒ
（）（）Ｂ１０ＡＫＲ１Ｂ１０ｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨＣＣ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＣＣＬＥｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
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乳腺癌肺转移精品PPT课件

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ER阴性者肺转移可能性大（3）
• 发现，在肺、肝组织中也存在ER。
单纯骨转移或骨转移为首次复发的患者常见于雌激素受体阳性和分化程度好的肿瘤，而肝、肺等其他部位转移的患者常发生在雌激素受体阴性和分化程度差
的肿瘤。
• 性激素的致癌作用是通过其受体介导机制实现的。
• ER阴性患者易出现肺、肝脏的转移。
7
是否完成化疗
• 是否完成化疗与术后肺转移呈负相关，未完成化疗者肺转移率高，化疗通过全身治疗，杀死手术不能解决的残存肿瘤细胞。
• 未完成化疗一定程度上提高了肿瘤转移的可能性。
8
影响因素（总结）
• 大多数患者的肺转移发生在术后3年内，原发肿块大，淋巴结转移数目多，ER阴性，TNM分期晚的浸润性癌患者更容易发生肺或肝的转移。
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男性乳腺癌
• 男性乳腺癌发病率仅占女性发病率的1%,其发病机理不明，可能与内分泌异常及男性乳房发育等因素有关。
• 病理学类型以乳腺浸润性导管癌最为常见，多呈浸润性生长，恶性程度较高，肺转移多见。
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男性乳腺癌
预后差
男性乳房乳腺组织较薄，细胞癌容易穿透乳腺组织进入区域淋巴结
医患双方对男性乳腺癌发病的警惕性低
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
13
治疗
• 手术 – 肺转移灶为单个或多个只局限于一叶或一侧肺内、一般情况好者，可行手术为主的综合治疗。
• 化疗 – 大多数肺转移性肿瘤为多发灶、病灶可相继出现，则化疗是转移性肺癌的主要治疗手段。

靶向沉默SIRT1对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

靶向沉默SIRT1对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响施鹏;陶辉;张家贵;曹炜;钱鹏;占红英;石开虎【摘要】目的探究沉默信息调节因子1(SIRT1)对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响作用.方法应用转化生长因子-β1处理乳鼠原代心肌成纤维细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测SIRT1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达水平;Western blot法检测SIRT1、α-SMA的蛋白表达水平;MTT法检测心肌成纤维细胞的细胞增殖活性;使用LipofectamineTM 2000 Reagent向乳鼠原代心肌成纤维细胞中转染siRNA-SIRT1.结果转染siRNA-SIRT1的心肌成纤维细胞,SIRT1蛋白和mRNA 表达下降,同时α-SMA蛋白和mRNA表达下降;转染siRNA-SIRT1明显抑制心肌成纤维细胞的增殖活性.结论 siRNA-SIRT1对心肌成纤维细胞增殖活性有明显抑制作用,SIRT1可能成为心脏结构重构防治的新靶点,其调控剂的应用将为心肌纤维化的防治提供新的思路和方案.%Objective To investigate the effect of silent information regulator 1(SIRT1) on the proliferation of cardiac fibroblasts in neonatal rat.Methods The original generation of rats cardiac fibroblasts were delt with TGF-β1.qRT-PCR was applied to assess the mRNA expression levels of SIRT1 and α-SMA.The protein expression levels of SIRT1 and α-SMA were detected by Western blot.MTT assay was used to determine the cytoactive of cardiac fibroblasts.LipofectamineTM 2000 Reagent was used to transfected cardiac fibroblasts with siRNA-SIRT1.Results The expression of SIRT1 protein and mRNA was down-regulated in the cardiac fibroblasts transfected with siRNA-SIRT1, as well as the α-SMA protein and mRNA expression.Theactivity of cardiac fibroblasts was restrained after transfected with siRNA-SIRT1.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2017(052)004【总页数】5页(P471-475)【关键词】SIRT1;心肌成纤维细胞;α-SMA【作者】施鹏;陶辉;张家贵;曹炜;钱鹏;占红英;石开虎【作者单位】安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥 230601;安徽医科大学心血管病研究中心,合肥 230601【正文语种】中文【中图分类】R542.23心肌纤维化是许多常见心血管疾病的最后阶段，其主要特点为细胞外基质蛋白呈网状沉积[1]，心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)是哺乳动物心脏中最丰富的细胞类型，CFs的活化增殖是心肌纤维化发生发展及心室重构的关键[2]。

抑制AKT通路对埃克替尼耐药的非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响

·502·· 论著 ·抑制AKT通路对埃克替尼耐药的非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响杨旸1，王一喆1，郑春雷2，侯科佐2，王晓楠1，胡雪君1（中国医科大学附属第一医院 1. 呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科； 2. 肿瘤内科，辽宁省抗肿瘤药物与生物治疗重点实验室，沈阳 110001）摘要目的探讨抑制AKT通路对埃克替尼耐药的非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响。

方法采取持续暴露并逐渐增加药物浓度方法筛选建立耐药细胞系，MTT法检测细胞增殖能力，Transwell法检测细胞迁移能力，Western blotting检测蛋白表达。

结果耐药细胞PC9/IcoR迁移能力高于PC9细胞（P < 0.05）；PC9/IcoR细胞表皮生长因子受体及AKT磷酸化水平明显高于PC9细胞（P < 0.05）；LY294002抑制AKT活化后PC9/IcoR细胞迁移能力明显下降（P < 0.05）。

结论抑制AKT通路可以抑制埃克替尼耐药的非小细胞肺癌细胞迁移。

关键词非小细胞肺癌；埃克替尼耐药；迁移； AKT通路中图分类号 R734.2 文献标志码 A 文章编号 0258-4646 （2019） 06-0502-05网络出版地址 /kcms/detail/21.1227.R.20190524.1325.014.htmlDOI：10.12007/j.issn.0258‐4646.2019.06.006Effects of AKT Pathway Inhibition on the Migration Ability of Icotinib-ResistantNon-Small -Cell Lung Cancer CellsYANG Yang1，WANG Yizhe1，ZHENG Chunlei2，HOU Kezuo2，WANG Xiaonan1，HU Xuejun1（ 1. Department of Respiratory and Infectious Disease of Geriatrics，Institute of Respiratory Disease，The First Hospital，China Medical University，She-nyang 110001，China； 2. Department of Medical Oncology，Key Laboratory of Anticancer Drugs and Biotherapy of Liaoning Province，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）Abstract Objective To investigate the effect of AKT pathway inhibition on the migration of PC9/IcoR cells. Methods The icotinib re-sistant cell line was established through continuous exposure of PC9 cells to gradually increasing concentrations of the drug. Cell proliferation，protein expression，and cell migration were analyzed through MTT assay，Western blotting，and Transwell assay，respectively. Results The migration ability of drug-resistant PC9/IcoR cells was higher than that of PC9 cells （P < 0.05） . The expression levels of the phospho-epider-mal growth factor receptor （p-EGFR） and phospho-AKT were higher in PC9/IcoR cells than in PC9 cells （P < 0.05） . Inhibition of the AKT pathway using LY294002 significantly decreased the migration ability of the PC9/IcoR cells （P < 0.05） . Conclusion Inhibition of the AKT pathway could inhibit the migration of icotinib-resistant non-small-cell lung cancer cells.Keywords non-small-cell lung cancer； icotinib-resistance； migration； AKT pathway研究［1-2］显示，肺癌是对人类健康威胁较大的恶性肿瘤之一，80%~85%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）；NSCLC发病率及死亡率逐年攀升。

Akt信号转导通路课件

从而解除它们对细胞周期的阻滞作用。
Akt与转录因子相互作用
03
Akt还能够与转录因子如NF-κB和FoxO等相互作用，调节它们
的转录活性，进而影响细胞周期的进程。
Akt对细胞凋亡影响
01
Akt磷酸化并抑制凋亡相关蛋白
Akt能够磷酸化并抑制多种凋亡相关蛋白，如Bad、Bax和Caspase-9等
，从而阻止细胞凋亡的发生。
目录
CONTENTS
01
Akt信号转导通路概述
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
ERA
Akt蛋白激酶简介
Akt蛋白激酶
是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于AGC激酶家族成员之一，参与细胞生长、增殖、存活和代谢等多种生物学过程。
Akt的激活
Akt的激活依赖于磷酸肌醇信号通路，通过磷酸化激活Akt激酶活性，进而调节下游靶蛋白的磷酸化状态。
02
Akt激活抗凋亡蛋白
Akt还能够激活多种抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL等，进一步增强细胞
的抗凋亡能力。
03
Akt调节线粒体功能
Akt可以调节线粒体的功能，维持线粒体膜电位和减少线粒体通透性转
换孔的开放，从而抑制细胞凋亡。
Akt与其他生长因子相互作用
Akt与胰岛素样生长因子（IGF）通路相互作用
IGF通路与Akt信号通路之间存在密切的相互作用。IGF受体激活后，可以招募并激活PI3K ，进而激活Akt。同时，Akt也可以磷酸化并激活IGF通路中的关键分子，形成正反馈调节。
Akt与表皮生长因子（EGF）通路相互作用
EGF通路与Akt信号通路之间也存在相互作用。EGF受体激活后，可以通过招募并激活 PI3K来激活Akt。同时，Akt也可以磷酸化并激活EGF通路中的关键分子，促进细胞的增殖和迁移。

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七、体内原位瘤生长和肺转移试验
实验用8~10周龄的雌性BALB/c小鼠。先将 4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞在指数增长期时消化下来，用PBS充分清洗后用 DME-10培养基重悬并计数(5x107/ml)将小鼠分为３组，每组11只。用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉小鼠，在每只小鼠的第五对乳腺各接种10μ l细胞。４周后，处死并称取原位瘤重量，观察肺表面转移结节数，并作统计学分析。实验重复３次。
Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力
立项依据
•
Akt1是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可通过
磷脂酰肌醇３激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活
。目前发现Akt有三个家族成员Akt1／PKBα 、Akt２／
PKBβ 、Akt３／PKBγ 。它们的氨基端含有１个血小板
－白细胞ｃ激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质—
MTT法检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1siAkt1-2细胞的增殖能力
4T1-Control ，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2 细胞荷瘤小鼠的原位瘤重量
Transwell法检测4T1-Control， 4T1-siAkt11和4T1-siAkt1-2的细胞迁移能力
蛋白质和（或）蛋白质—蛋白质之间的相互作用。Akt
通过ＰＨ区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇
3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上，并通过上游磷脂
酰肌醇依赖性激酶1,2(PDK1、PDK2）磷酸化进入活化
状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其
他部位，磷酸化大量的底物蛋白，最终调节细胞的增
实验结果
Akt1干扰载体pLKO.1-Control，pLKO1.1-siAkt1-1 和pLKO.1-siAkt1-2的酶切鉴定电泳图谱
定量PCR检测4T1-control，4T1-siAkt1-1和 4T1-siAkt1-2细胞中Akt1mRNA表达量
免疫印迹检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1siAkt1-2细胞中Akt1蛋白表达量
研究目标和内容
作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著增高，促进肿瘤转移；但也有研究表瘤发生发展过程中的作用，采用RNA干扰技术沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT 法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力。Transwell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能力。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力，但显著降低其体内肺转移能力。结果表明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用，并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。
殖、分化、存活和迁移等。
近年来研究发现，Akt1不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加；活化的Akt1促进人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的侵袭能力，但可抑制MDA-MB-2 ３１细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1 异常表达和活性改变，并在乳腺癌的转移过程中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介导的乳腺癌体内转移；而过表达myr-Akt1可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化还可促进Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵袭能力。这些结果表明，Akt1在不同的细胞型或肿瘤的不同发展阶段所起的作用也不同。
计划和方案设计
一、细胞株与培养基小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME-10培养基培养环境为37℃培养箱，饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰
-酶0.02％EDTA消化传代细胞。二、Akt1干扰载体的构建
慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列为阴性对照（表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断，克隆到U6启动子下游的EcoRI和AgeI酶切位点(EcoRI和 AgeI酶切位点之间原先存在约1800bp的无关DNA片断），转入大肠杆菌DH5α 。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克隆pLKO.1-siAkt1-１,pLKO.1-siAkt1-1-2和pLKO.1Control,并测序验证。
三、Akt1沉默细胞株的构建:用磷酸钙法转染HEK293T细胞并经过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株4T1-siAkt11、4T1-siAkt1-2和对照细胞株4T1-control.
四、定量PCR和免疫印迹分析五、MTT法检测细胞增殖活性:分别将对数生长期的３组
乳腺癌细胞4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt12用0.25%胰酶消化,DMEM配制成单细胞悬液,接种于96 孔板中,每组６孔,每孔约1×104个细胞，体积100μ l, 置于5%CO2,37℃培养48h。每孔加入20μ l MTT溶液 (5mg/ml),37℃孵育4h,吸出培养基上清，150μ lDMSO 充分溶解。酶标仪测定吸光度(A)(测定波长570nm，参比波长630nm)实验重复３次。
六、Transwell法测定细胞迁移力
实验中采用6.5mm直径,10μ m厚度,8μ m孔径的聚碳酸酯多孔滤膜。取对数生长期细胞，胰酶EDTA消化收集细胞，离心(1000r/minx5min)弃上清,血清DMEM洗涤１次，加入无血清DMEM，细胞计数，用无血清培养基重悬细胞至5x105个细胞 /ml；上室每孔加入10μ l细胞悬液,下腔室中加入600μ l含Fn的培养基,37℃培养箱中培养24ｈ；取出Transwell并用PBS洗３次，5%戊二醛4℃ 固定0.5h；PBS洗３遍，加入结晶紫(0.1％)室温染色0.5h；PBS洗３遍，用脱脂棉擦去上表面细胞，显微镜下观察，取５个视野照相，计数记录。实验重复至少３次，结果相似。