pvdf膜甲醇激活时间
WB试验参考
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
PVDF聚偏氟乙烯
PVDF聚偏氟乙烯，分子式：-(C2H2F2)n- ，英文缩写poly(vinylidene fluoride)，主要是指偏氟乙烯均聚物或者偏氟乙烯与其他少量含氟乙烯基单体的共聚物，它兼具和通用树脂的特性，除具有良好的耐化学腐蚀性、耐高温性、耐氧化性、耐候性（可在户外长期使用）、耐辐射性能外，还具有压电性、介电性、热电性等特殊性能，化学结构中以氟一碳化合键结合，这种具有短键性质的结构与氢离子形成最稳定最牢固的结合。
PVDF亲水性较差。
PVDF膜在处理前是疏水性的膜，经过甲醇处理后，PVDF膜就成了亲水性的了。
这个你在实验中也应该看到了。
所以，只要用甲醇处理PVDF膜30s左右就可以完全的把PVDF膜从疏水性状态转变成亲水性的了，时间延长后效果都是一样的。
同时，用肉眼观察，膜表面是否还有白色的点状或者块状区域存在，没有了再浸泡到transfer buffer中15 min。
用过millipore、Pall-Gelman、osmonics的PVDF膜，都是在甲醇中浸泡1-2 MIN。
millipore公司的膜说明书都说的是在甲醇中浸泡1-2min。
PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PVDF作为替代品，虽然PVDF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。
PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。
这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于的检测。
但是使用PVDF膜前，一定要先用无水甲醇预处理，再在transfer buffer中平衡好才可以使用（PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合）。
经过预处理的PVDF膜在转膜时，可以使用不含甲醇的transfer buffer。
WB常见问题2
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C.细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？解答：一般5×10^6就足够了D.同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？解答：能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
WB完整步骤
WB完整步骤Weternblot步骤：配胶制胶跑胶转移胶（转膜）封闭和孵抗体扫膜一.配胶这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。
SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。
1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）2.浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，二制胶1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。
30分钟胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。
此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气2.灌积层胶5%（统一）40min说明：可延长，宁长勿短。
Western_Blot常见问题(12)
常见问题做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。
我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。
至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。
一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。
另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）W. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。
稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
(整理)实验步骤-westernbloting实验流程-5临床医.
Western blotting实验流程实验流程共分为6步：1 待测蛋白的准备；2 蛋白电泳；3 转膜；4 抗体结合；5 曝光；6 灰度值统计分析。
一、待测蛋白的准备1.细胞蛋白的提取：（1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上放置10分钟裂解。
（2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用PBS 或水冲洗细胞刮，洗后甩干），收集裂解液于1.5ml EP管中，置于冰上裂解20分钟，期间需用振荡器振荡混匀3次，每次15秒左右（3）12000rpm，4℃冷冻离心5min左右，收集上清置于新EP管，存于-80℃。
2. BCA法蛋白溶液浓度测定（具体步骤按试剂盒说明书）（1）配制BCA工作液：打开37℃恒温箱预热加温，取出BCA标准品与蛋白样品解冻，配BCA工作液，A：B=50：1，A液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*200µl，B液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*4µl，配好后混匀。
（2）配制BCA标准品与标准曲线：用PBS稀释好标准品，按说明书将标准品加入到96孔板中，再补加PBS到一样体积。
（3）配制蛋白样品：每孔加入5µl蛋白原液，补加PBS稀释（稀释可节省蛋白，记住稀释倍数，蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测；蛋白孔可做2~3个平行孔，测量时取平均值较准）（4）加入BCA工作液：每孔各加200µl已配好的工作液，盖上板盖混匀30秒，37℃孵育30min，放好蛋白样品。
（5）测蛋白浓度：打开酶标仪预热10分钟以上，孵育完后取出96孔板冷却到室温，用移液枪去除小气泡，用纸巾擦干96孔板板度水珠，调节酶标仪波长，放入打印纸，打开96孔板板盖，在570nm波长下读取数值，空白孔可设可不设。
（具体按酶标仪操作说明，可以测几次选取）（6）计算浓度：用EXCELL表格制作标准直线方程，计算待测蛋白浓度（若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度），然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。
WB protocol
western Blot检测
所需溶液配制：
1)转膜缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L
2)PBST 缓冲液：称取8 g NaCl、0.2g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于1L超纯水中。
再加入1ml Tween 20即是PBST。
步骤：
1) 取一定量的蛋白样品，SDS-PAGE电泳，结束后取出凝胶放入转膜缓冲液中浸泡5min左右；
2) 准备PVDF膜：将剪裁成适当大小的膜在甲醇中浸泡10sec，再在双蒸水中浸洗2min，最后浸于转膜缓冲液中至少10min；
3) 拿到凝胶后按如下顺序夹好凝胶:负极-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-正极，用转膜缓冲液浸湿，并将气泡赶走，转膜结束后切角标记PVDF膜，并用铅笔标记正面；
4) 封闭：将膜先在PBST中漂洗3-4次，每次5-10min ，再放入5-10%的脱脂牛奶中浸泡，室温震荡2-3h(或4℃过夜)；
5) 加一抗：将一抗用10%的脱脂牛奶或PBST按一定比例稀释后，将膜浸入其中，摇床上孵育2-3h后取出，在PBST中漂洗3-4次，每次5-10min;
6) 加二抗：用PBST稀释二抗，将膜在二抗中孵育30min后取出，在PBST中漂洗3-4次，每次5-10 min；
7) 显色：经ECL显色试剂盒反应后，用X-光胶片曝光显影。
转膜buffer（5×）15.1375g Tris，72.0672g gly。
Western Blot 实验方法&注意细节2015
Western Blot 实验方法参考以下是根据个人实验总结的方法，所以可能有些步骤和他人具体实验有出入，仅供交流参考。
红色标注是重点注意的，易影响后期操作结果的。
写了能想到的细节，故看起来较琐碎，不连贯。
1.蛋白质变性按比例蛋白中加入载样缓冲液，混匀瞬离。
PCR仪95℃ 7--8min ，每孔最大上样量25ul，但超过20ul跑出来的就不好看了，十几ul比较合适；预染marker 2.5ul就可以较好显出，建议文章并图加大用量。
（以上是我个人实验的用量，之后不在说明。
）蛋白加样等操作做建议严格冰上执行。
2.配胶建议早上一来先开始配胶，胶干过程中再其他操作。
10%分离胶（5ml）H2O 1.9ml3%AB 1.7m1.5M Tris-HCL(pH8.8) 1.3ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul4%浓缩胶（3ml）H2O 2.1ml3%AB 0.5ml1M Tris-HCL(pH6.8) 0.38ml10%SDS 30ul10%AP 50ulTEMED 5ul2.1安装玻璃板取出干净、无水的玻璃板，一次性垂直固定在架子上，卡好后切勿用手再去拨动按压，如此易漏胶。
架子水平放置，后期压线平直，具体可专门安置出一块水平地方，单独留于做WB配胶。
2.2分离胶配置制分离胶时按照配方顺序加样，每加一种摇动混匀，避免后期胶的成分不均匀影响跑样。
尤其是AP，TEMED加入后，TEMED主要用于凝胶，其用量决定胶凝固的时间长短，操作时快速。
灌胶时可用大枪，固定在玻璃板一侧加，不移动加样。
全部加完胶后摇一摇架子，使胶分布均匀，线水平。
之后加水压线，加水时枪尽量放水平，缓速边移动边加，如此是为了水均匀压到胶面上，避免同一个地方加水而使胶面难以恢复水平。
凝胶时间具体配方、温度不同，我后期用以上配方，40min室温凝胶（5-6月）效果很好，禽方向当时时间也差不多如此。
个人试过的最长室温凝胶时间2h，效果和后期用的这种目测无差别。
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pvdf膜甲醇激活时间
摘要：
1.介绍PVDF 膜
2.解释甲醇激活时间的概念
3.讨论PVDF 膜的甲醇激活时间的影响因素
4.总结PVDF 膜甲醇激活时间的重要性
正文：
聚偏氟乙烯（PVDF）膜是一种广泛应用于分离、过滤和防护等领域的高分子材料。
在PVDF 膜的应用过程中，甲醇激活时间是一个关键参数，影响着膜的过滤效率和稳定性。
甲醇激活时间指的是在甲醇溶液中，PVDF 膜的孔隙结构被改变，达到最佳过滤状态所需的时间。
甲醇作为一种有机溶剂，可以改变PVDF 膜的物理结构，提高膜的过滤性能。
在甲醇激活过程中，PVDF 膜的孔隙大小和孔隙分布会得到优化，从而提高膜的分离效率。
PVDF 膜的甲醇激活时间受多种因素影响，例如甲醇的浓度、浸泡时间、温度等。
一般来说，甲醇浓度越高，激活时间越短；浸泡时间越长，激活时间也越长；温度越高，激活时间越短。
然而，这些因素对甲醇激活时间的影响并非线性关系，需要在实际应用中进行优化，以达到最佳的激活效果。
PVDF 膜甲醇激活时间的重要性在于，合适的激活时间可以确保膜的过滤性能和使用寿命。
如果激活时间过短，膜的结构改变不充分，可能导致过滤效率较低；如果激活时间过长，可能会导致膜的稳定性下降，影响其使用寿命。
因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的甲醇激活时间。
总之，PVDF 膜的甲醇激活时间是一个关键参数，影响着膜的过滤效率和稳定性。