NC膜与PVDF膜的区别
蛋白质印迹法的基本过程
蛋白质印迹法的基本过程一、引言蛋白质印迹法是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测蛋白质的存在和定量。
它可以检测蛋白质在不同样本中的表达水平，以及蛋白质在不同时间点或处理条件下的变化。
本文将介绍蛋白质印迹法的基本过程。
二、材料和仪器1. 蛋白质样品：需要纯化后的蛋白质样品，可以通过离心、层析等方法进行纯化。
2. 聚丙烯酰胺凝胶：需要选择合适的凝胶浓度和孔径大小，以适应不同分子量的蛋白质。
3. 聚丙烯酰胺电泳缓冲液：需要根据凝胶类型和电泳条件选择不同配方的缓冲液。
4. 转移装置：可以使用湿式或半湿式转移装置。
5. PVDF或NC膜：需要根据转移方式选择合适的转移膜。
6. 阻断剂：如牛血清白蛋白（BSA）、干奶粉等，用于防止非特异性结合。
7. 一抗和二抗：需要选择合适的抗体，以特异性识别目标蛋白质。
8. 显色剂：可以使用ECL或BCIP/NBT等显色剂。
9. 蛋白质定量试剂盒：如BCA、Lowry等试剂盒，用于测定蛋白质样品的浓度。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 制备凝胶：按照所选凝胶类型的说明书制备聚丙烯酰胺凝胶，通常需要加入TEMED和过硫酸铵等催化剂促进凝胶聚合。
将凝胶混合物注入电泳槽中，在上方加入少量异丙醇，以防止凝胶表面形成气泡。
待凝固后，去除异丙醇并加入缓冲液。
2. 样品加载：将纯化后的蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，并在沸水中预处理5-10分钟。
将处理后的样品加载到凝胶孔中，注意不要过载。
3. 电泳条件：根据所选凝胶类型和蛋白质分子量的大小，选择不同电泳条件进行电泳。
通常需要在常温下电泳1-2小时。
4. 凝胶染色：将凝胶浸泡在染色液中，如Coomassie蓝染色液或银染色液中，以可视化分离的蛋白质带。
四、半干式或湿式转移1. 准备转移装置：根据所选转移方式，准备相应的转移装置和转移缓冲液。
2. 转移条件：根据所选转移方式和蛋白质分子量的大小，选择不同的转移条件进行转移。
通常需要在低温下（4℃）进行数小时至过夜。
过滤膜的选择
过滤膜的选择1.尼龙膜(Nylon)特点：耐温性能良好，可耐121℃饱和蒸汽热压消毒30min，最高工作温度60℃，化学稳定良好，能耐受稀酸、稀碱、醇类、酯类、油类、碳氢化合物、卤代烃及有机氧化物等多种有机和无机化合物。
用途：电子、微电子、半导体工业水过滤、组织培养基过滤。
药液过滤、饮料过滤、高纯化学制品过滤、水溶液和有机流动相的过滤的过滤。
2.聚偏氟乙烯膜（PVDF）特点：膜机械强度高、抗张强度高，具有良好的耐热性和化学稳定性，蛋白吸附率低；具有较强的负静电性及疏水性；具有疏水和亲水两种形式。
但不能耐受丙酮，DMSO，THF，DMF，二氯甲烷，氯仿等。
用途：疏水性聚偏氟乙烯膜主要应用于气体及蒸汽过滤、高温液体的过滤; 亲水性聚偏氟乙烯膜主要应用于组织培养基、添加剂等除菌过滤溶剂和化学原料的净化过滤，试剂的无菌处理，高温液体的过滤等。
3.混合纤维素酯特点：孔径比较均匀，孔隙率高，无介质脱落，质地薄，阻力小，滤速快，吸附极小，使用价格成本低，但不耐有机溶液和强酸、强碱溶液。
用途：医药工业需热压灭菌的水针剂，大输液滤除微粒。
对热敏性药物(胰岛素ATP、辅酶A等生化制剂)的除菌，用0.45微米的滤膜(或0.2)溶液中微粒及油类不溶物的分析测定，及水质污染指数测定。
应用于体细胞杂交和线粒互补预测杂种优势研究等科研部门。
4.聚丙烯特点：无任何粘接剂，化学性能稳定，柔韧，不易破损，耐高温，能经受高压灭菌。
无毒无味，耐酸碱。
用途：适用于制作各种粗、精滤器，折叠式滤芯。
适用于饮料、医药等行业的板框压滤机滤膜。
适用于反渗透膜，超滤膜的支撑及预处理。
聚丙烯膜无毒性，可在医药、化工、食品、饮料等领域广泛应用；具疏水性，对气体过滤尤佳。
5.聚醚砜(PES)特点：醚砜材质的微孔滤膜，属于亲水性滤膜，具有高流率、低溶出物、良好的强度的特点，不吸附蛋白和提取物，对样品五污染。
用途：低蛋白质吸附及高药物相容性，专为生化、检验、制药以及除菌过滤装置而设计。
NC膜,PVDF膜和尼龙膜的区别
NC膜、PVDF膜、尼龙膜的应用及差别硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，NC膜在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到，杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。
固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。
固相支持物常用硝酸纤维素膜。
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
大于20000的蛋白选用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um 的膜。
PVDF膜使用是需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。
PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。
尼龙膜是一种合成的长链聚酰胺薄膜，对核酸和蛋白质具有很强的结合能力，能代替硝酸纤维素薄膜用于分子印迹和杂交实验。
NC膜、PVDF膜、尼龙膜的差别：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
1. 就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp 的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
2. 就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
NC膜,PVDF膜和尼龙膜的区别
NC膜、PVDF膜、xx膜的应用及差别硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)，NC膜在NorthernBlot、SouthernBlot、WesternBlot中都需要用到，杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。
固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。
固相支持物常用硝酸纤维素膜。
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
大于200的蛋白选用0.45um的膜，小于200的蛋白选用0.2um的膜。
PVDF膜使用是需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。
PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。
尼龙膜是一种合成的长链聚酰胺薄膜，对核酸和蛋白质具有很强的结合能力，能代替硝酸纤维素薄膜用于分子印迹和杂交实验。
NC膜、PVDF膜、xx膜的差别：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
1.就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp 的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
2.就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
3.就重复性而言：⑴、尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
免疫印记手册第六版
《蛋白质印迹手册》第六版Western blotting技术作为生物实验室中最给力的工具之一，一直被研究人员广泛使用。
默克密理博公司的《蛋白质印迹手册》（Protein Blotting Handbook）详细介绍了western blotting的原理、操作和技巧，无论是对初学者，还是对希望进一步优化实验的达人，都将带来极大的帮助。
最新第六版的手册在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的指引，同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤，是蛋白质印迹实验不可缺少的好伙伴。
一、膜的选择摘要：PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？我们该如何选择？近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。
它目前提供三种PVDF膜。
这三种膜有何不同，分别适合哪些应用呢？详见本文。
印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：•蛋白质结合能力•是否需要用醇预湿•开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力•蛋白质观察•长期印迹保存•信噪比聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素(NC)是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。
硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。
表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。
PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性（Pluskal等，1986）。
其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。
使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测（Kurien等，2003）。
市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 –100 μg/cm2，而PVDF膜的结合能力是100 –200 μg/cm2。
在检测血清中人免疫缺陷病毒（HIV）时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测（Lauritzen和Pluskal，1998）。
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测.主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测.样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织(需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种,RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP—40、Tritonx-100.2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注:1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声,因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1:1混匀.4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%（w/v)N,N'—亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N—亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶,4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合,在蛋白质表观分子量分析时影响大.2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧,避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面,其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
蛋白核酸杂交转印膜(PVDF膜和尼龙膜)介绍
蛋白、核酸杂交转印膜（PVDF、尼龙膜）技术介绍转印膜：用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。
Southern blot：又称Southern 印迹杂交，是研究DNA 图谱的基本技术。
Northern blot：又称Northern 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是检测RNA的基本技术。
Western blot：又称Western 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是蛋白质检测分析的基本技术。
转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛，不同的转印膜规格和参数不同，选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。
常用的转印膜对比：常用的三种转印膜：硝酸纤维素膜（NC 膜）、带正电的尼龙膜（N66膜）、聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）。
C ob e t t er三种转印膜结合DNA或RNA的能力：带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。
三种转印膜机械强度比较：硝酸纤维素膜较脆，易破碎，不能重复使用；尼龙膜和PVDF 膜机械强度较高，可重复使用。
带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段，因此是最理想的核酸杂交转印膜。
PVDF膜机械强度高、耐高温，是蛋白印迹最理想的转印膜。
Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜，Cobetter杂交转印膜的种类如下：retteboC⏹N66尼龙转印膜⏹N66尼龙带正电荷转印膜⏹PVDF疏水转印膜⏹PVDF亲水转印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um 两种。
CobetterN66尼龙转印膜：相比起硝酸纤维素膜而言，其机械强度高，在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，可重复使用，非常适用于核酸检测。
制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团，使用过程中不需要再做预润湿处理。
通过在膜表面嫁接羟基基团，改变其表面电荷性能（正电），使得其能紧密结合DNA 而降低背景，快速结合DNA。
Western-blot常见问题解答
Western Blot详解－常见的问题指南实验常见的问题指南《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
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NC膜与PVDF膜的区别
材料科学领域中，膜材料是一种关键的功能性材料，广泛应用于许
多行业。
NC膜（聚醋酸纤维素膜）和PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）是两
种常见的膜材料，它们在性能和应用方面存在着一些差异。
本文将探
讨NC膜与PVDF膜的区别，并分析它们在不同领域的应用。
1. 化学性质：
NC膜是由聚醋酸纤维素制成的，聚醋酸纤维素是一种天然纤维素。
NC膜具有较好的耐溶剂性和化学稳定性，能够在广泛的 pH 范围内使用，不易受到化学物质的影响。
而PVDF膜是由聚偏氟乙烯制成的，
聚偏氟乙烯是一种合成高分子材料。
PVDF膜在酸、碱和溶剂等各种化学物质的环境下都具有较好的稳定性。
2. 物理性质：
NC膜具有良好的热稳定性和机械强度，能够在高温和高压环境下
使用。
它具有较高的热变形温度，能够在 200°C 以上的温度下保持稳定。
PVDF膜也具有较好的热稳定性和机械强度，但其热变形温度较
NC 膜低，通常在 150°C 左右。
3. 水分通透性：
NC膜在水分通透性方面具有优势，它具有较高的水分透过率，可
以有效地过滤水溶性溶剂和溶剂蒸气。
而PVDF膜在水分通透性方面
相对较低，透过率相对较小，适用于一些对水分透过性要求不高的应
用场景。
4. 分离性能：
NC膜和PVDF膜在分离性能上也有所不同。
NC膜具有较好的分离性能，能够有效地分离溶剂和其他溶液成分。
PVDF膜在分离性能方面相对较弱，适用于需要相对较低分离效率的应用。
根据以上的区别，NC膜和PVDF膜在不同领域有不同的应用。
1. NC膜的应用：
NC膜广泛应用于水处理、药物输送、食品加工等领域。
由于其较高的耐溶剂性和化学稳定性，它被用于过滤和分离各种溶剂和溶液。
在水处理领域，NC膜可以有效地去除水中的悬浮物和杂质，实现净水的目标。
在药物输送领域，NC膜可用于控制药物释放速率，提高药物的疗效。
在食品加工领域，NC膜可用于浓缩果汁、分离乳制品中的乳脂等。
2. PVDF膜的应用：
PVDF膜主要应用于微电子行业、化学工业和电池领域。
由于其较好的热稳定性和化学稳定性，以及较低的水分透过率，PVDF膜被广泛用于气体分离、液体过滤和电池隔膜等领域。
在微电子行业中，PVDF 膜可以用于制备高纯度的化学品，以及过滤和分离微细颗粒物。
在电池领域，PVDF膜可用作锂离子电池的隔膜，防止正负极之间的短路。
综上所述，NC膜与PVDF膜在化学性质、物理性质、水分通透性和分离性能等方面存在差异。
它们在不同领域具有不同的应用，能够满足各种特定需求。
随着科学技术的不断发展，人们对膜材料的要求
也在不断提高，相信NC膜和PVDF膜在未来会得到更广泛的应用和改进。