细胞培养工作流程
细胞培养基本步骤
细胞培养基本步骤细胞培养是一项重要的生物技术，涉及到多个步骤。
以下是细胞培养的基本步骤：1. 准备细胞培养环境：细胞培养需要在无菌的环境中进行，因此需要准备无菌操作台、培养箱、显微镜、细胞计数器等设备，确保培养环境符合要求。
2. 细胞复苏：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速转移到37℃水浴中解冻。
然后将细胞移至培养瓶中，加入适量培养基，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布。
3. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可以进行传代。
将原培养瓶中的培养基吸出，加入适量胰蛋白酶，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶与细胞接触。
等待几分钟，待细胞变圆并从瓶底脱落，将胰蛋白酶吸出。
然后加入新配置的培养基，用吸管吹打细胞团块，使其分散成单个细胞。
最后将细胞悬液移至新的培养瓶中，放在培养箱中继续培养。
4. 细胞冻存：当需要进行长期保存时，可以将细胞冻存。
将细胞从培养箱中取出，离心收集，用适量细胞冻存液重悬细胞。
然后将细胞悬液分装到冻存管中，放入-80℃冰箱或液氮中保存。
5. 细胞观察：在细胞培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态、密度等指标，判断细胞的生长状态和是否发生异常。
如发现异常情况，应及时采取措施处理。
6. 细胞计数和活力检测：采用细胞计数器或血球计数板进行细胞计数，同时检测细胞的活力。
一般采用台盼蓝染色法或荧光染色法进行检测。
7. 细胞换液和传代：根据需要，定期更换新鲜的培养基，以保证细胞的营养需求。
同时，在传代过程中要注意细胞的消化程度和生长情况，避免过度生长或未充分消化导致细胞状态不佳。
总之，细胞培养是一项技术性很强的工作，需要严格的操作规程和细致的观察。
通过不断实践和总结经验，可以提高细胞培养的成功率和稳定性。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序(SOP)1.目的:为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。
2.适用范围:适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3.操作规程:3、1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3、1、1 1000ml培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2、0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3、7g等),再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7、0左右(细胞适宜在PH7、2～7、4生长,配制好后PH值会升高0、2～0、3,故配时调PH至7、0左右)。
5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0、5ml青霉素与0、4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0、22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。
注意:(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl与(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度与质量。
(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
根据不同细胞类型的要求，可以选择不同的培养基配方。
培养基常见的成分包括无菌水、氨基酸、糖类、脂质、无菌血清、维生素等。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
可以使用显微镜对细胞进行观察和记录，以判断细胞的健康和增殖情况。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
在实验中，细胞可能需要通过一些特殊处理，如细胞冻存、细胞分离、染色等。
细胞培养流程
细胞培养流程细胞培养是生物学实验中常见的一项技术，它可以帮助研究人员观察和研究细胞的生长、分化和代谢等生物学特性。
在进行细胞培养实验时，需要严格按照一定的流程和操作规范进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
下面将介绍一般的细胞培养流程，希望对初学者有所帮助。
1. 材料准备。
在进行细胞培养实验之前，首先要准备好所需的材料，包括培养基、培养皿、细胞传代液、无菌吸管、移液器、离心管等。
这些材料需要提前消毒和准备，以确保实验过程的无菌性和安全性。
2. 细胞解冻。
如果是从冻存状态的细胞开始培养，首先需要将细胞解冻。
解冻的过程需要在无菌工作台内进行，使用预先加热的培养基缓慢将细胞解冻，然后将细胞悬于完整培养基中。
3. 细胞传代。
一旦细胞达到一定的密度，就需要进行传代。
传代是指将已培养的细胞分离并重新接种到新的培养皿中，以保持细胞的活力和增殖。
在传代的过程中，需要注意细胞的数量和培养基的配比，以确保细胞的健康生长。
4. 观察细胞生长。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态、数量和活性，及时发现并处理细胞的异常情况，如细胞凋亡、感染等。
5. 细胞收获。
当细胞达到所需的数量和状态时，就需要进行细胞的收获。
收获细胞时，需要使用适当的酶溶解细胞，并进行离心等操作，最终获得细胞沉淀物。
6. 细胞冻存。
如果需要长期保存细胞，就需要进行细胞的冻存。
在冻存前，需要将细胞悬于含有冻存剂的培养基中，然后将细胞缓慢冷冻至液氮温度，以确保细胞的冻存质量。
以上就是一般的细胞培养流程，当然在实际操作中还会根据不同的细胞类型和实验目的进行一些细节上的调整。
希望初学者能够通过这些基本步骤，掌握细胞培养的基本技术，为日后的实验工作打下坚实的基础。
细胞培养常规操作流程
细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique in biological research, allowing scientists to study and manipulate cells in a controlled environment. The standard procedure forcell culture involves several key steps.First, I need to prepare the culture medium. This is the nutrient-rich solution that provides cells with the necessary nutrients and growth factors to survive and multiply. The medium is usually composed of a basal medium, such as DMEM or RPMI, supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, and other additives. I carefully measure and mix the components to ensure a proper balance of nutrients.Next, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact with the cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. Sterilization can be achieved by autoclaving, which uses high-pressuresteam to kill any microorganisms present. Alternatively, I can use a filter to remove bacteria and fungi from the media.Once everything is sterilized, I can start the cell culture process. I thaw frozen cells or obtain fresh cells from a tissue sample. I then count the cells using a hemocytometer or an automated cell counter. This step is important to determine the cell density and ensure that I seed the appropriate number of cells for the experiment.After counting the cells, I seed them into the culture dishes or flasks. The dishes are usually coated with a substance that promotes cell attachment, such as collagen or gelatin. I carefully distribute the cells evenly across the surface and place the dishes in an incubator set at the appropriate temperature and CO2 concentration. The incubator provides a controlled environment that mimics the conditions inside the body.Over the next few days, I regularly check the cells under a microscope to monitor their growth and health. Ialso change the culture medium every 2-3 days to provide fresh nutrients and remove waste products. This process is known as feeding the cells.Sometimes, I need to subculture the cells to maintain their health and prevent overcrowding. This involves detaching the cells from the culture dish using an enzyme called trypsin, and then transferring them to a new dish with fresh medium. Subculturing allows the cells to continue growing and dividing without becoming too dense.Throughout the cell culture process, I need to maintain aseptic technique to prevent contamination. This means working in a clean and sterile environment, wearing gloves, and using sterile tools. Contamination can lead to the growth of unwanted microorganisms and compromise the experiment.In conclusion, cell culture is a meticulous processthat involves preparing the culture medium, sterilizing equipment, seeding the cells, maintaining them in the incubator, and regularly feeding and monitoring theirgrowth. It requires attention to detail, patience, and aseptic technique to ensure successful cell culture experiments.中文回答：细胞培养是生物研究中的一项基本技术，允许科学家在受控环境中研究和操作细胞。
细胞培养车间工作流程
细胞培养车间工作流程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
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细胞培养工作流程-标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。
1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。
1.5复苏用水准备：（1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
（2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
1.6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。
1.7溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。
4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。
核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。
然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。
同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。
迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。
5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。
6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。
24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。
7、清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。
9、换液换液前准备与复苏前相同。
观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4ml/cm2）。
拧紧瓶口，平放到恒温室培养。
最后按规定清场二、细胞传代流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
1.2设施检查：确认空调、蠕动泵工作状态完好。
1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液（含0.25%的胰蛋白酶溶液）。
2、传代1操作2.1配液向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
2.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：30ml/ T75 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
2.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
2.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
2.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中，，加生长液至75ml。
2.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
2.7清场按规定清场2.8观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作3.1配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
3.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
3.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
3.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
3.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。
3.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
3.7清场按规定清场3.8观察每天观察细胞生长状态4、传代3操作4.1配液配方辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。
辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。
然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。
注意事项：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位（除吸管后端的任何位置），如不慎碰到应立即废弃。
安装管道过程中，如管道不慎碰到其他部位应立即废弃。
4.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
4.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。