HRP底物分类
过氧化氢纳米酶底物ODP、ABTS、TMB显色
ELISA检测中常见的纳米酶及底物；过氧化物酶HRP，ELISA检测过氧化氢纳米酶底物检测ODP、TMB、ABTS显色反应步骤苏州健雄职业技术学院周帅康HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(0PD)、2, 2 -吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6), ABTS](杂环吖嚷)、四甲基联苯胺(TMB)和4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。
上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4-氨基安替比林：苯酚等。
(一)氧化还原色原底物0PD被以为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202)氧化而聚合成2, 2 -二氨基偶氮苯(DAB)。
在pH5. 0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1. 0时，最大吸收波长移动至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4-2)。
因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。
实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化0PD而产生非酶催化的DAB的结果。
有人在强酸反应终止液中加进还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了oro的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。
oro的缺点是其对机体具有致突变作用。
由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供给，临用时再溶解于相应的缓冲液。
在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0. lmol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH5. 0)中含20mmol/L0P D和12 mmol /L H202,或10 mmol/L 0PD和5. 5mmol/L H202;②终止液：2 mol/L硫酸(含0.1 mol/L亚硫酸钠）；③测定波长：492nm。
TMB是一种优于0PD的新型HRP色原底物。
hrp结构
hrp结构
HRP 结构是指人类重组胰岛素前体(Human Recombinant Proinsulin) 的结构。
在胰岛素的生物合成过程中，胰岛素原先经过蛋白酶裂解后，形成由A 链和B 链组成的成熟胰岛素。
而在重组DNA 技术的发展下，科学家们可以通过基因工程技术将胰岛素原基因重组到大肠杆菌中，使其在大肠杆菌中表达合成，最终得到重组的胰岛素前体。
HRP 结构由三个部分组成：A 链、B 链和C 链。
其中，A 链和B 链分别为成熟胰岛素中的两个多肽链，而C 链则是由胰岛素原分子中的连接肽 (connecting peptide) 部分构成。
HRP 结构中的 C 链在合成后会被内切酶裂解掉，从而得到成熟的胰岛素分子。
HRP 结构的研究对于胰岛素生产和药物研发具有重要的意义。
通过对 HRP 结构的深入了解，科学家们可以更好地理解胰岛素的生物合成过程，并且可以通过对 HRP 结构的改良来优化胰岛素的生产效率和质量。
此外，HRP 结构还可以为药物研发提供重要的参考，例如在胰岛素治疗方面，研究人员可以通过对 HRP 结构的研究来设计更加有效和稳定的胰岛素类似物 (insulin analogs)。
HRP 结构是一种重要的蛋白质结构，对于胰岛素生产和药物研发具有重要的意义。
通过对 HRP 结构的深入研究，我们可以更好地理解胰岛素的生物合成过程，并且可以为胰岛素的生产和药物研发提供
更加精准和有效的参考。
HRP标记抗体原理及方法(戊二醛二步法和过碘酸钠法)
HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA 等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
wb-ECL
substrate | ECL substrate成分：本品为辣根过氧化物酶（HRP）发光底物，分A液和B液两瓶，A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。
特征/优点：分A液和B液，使用时1:1混合；皮克级灵敏度：高度灵敏性可快速检测较宽水平范围内的蛋白质；发光信号早：加入底物后2分钟即可检测；发光信号强；发光持续时间长：平台期持续半小时以上，持续发光24h；经济：比任何其它进口化学发光底物产品花费更少；方便：全国范围内2日左右到货，大小包装均可提供；技术服务到位：专门从事化学发光试剂盒开发的技术人员为您解决各种问题；优良的稳定性：4℃存放可达18个月以上。
贮存：4℃（2－8℃）。
有效期：18个月使用方法：使用时将A液与B液取出，平衡至室温，1:1混合后立即使用，也可每孔先加A液50uL，再加B液50uL，置室温反应。
可在加入底物后2～30分钟读取发光信号。
注意事项：1、HRP的发光底物分A液和B液，A、B液应该使用时现用现配，如果A、B液混合时间过长，将造成发光本底过高，阳性值发光信号过低。
2、使用前室温平衡20min，低温可能会影响产品的发光强度。
3、避光保存，防止暴晒，防止污染。
4、84消毒液（次氯酸钠）等强氧化剂对HRP发光底物有严重的影响，84消毒液有很大的挥发性，在空气中极低的浓度即可引起发光本底升高（1万～十多万），有时候一次使用完84消毒液可以影响到后面几天的试验，所以建议在试验时勿使用84消毒液，可采用其它消毒液代替（如酒精、二氧化氯消毒剂等），若不得已使用完后应保证实验室通风。
5、本底高 a.建议用一个未包被的空白板（什么都不加）直接测，然后再加几孔发光底物直接测，进行对比，以排除应发光板对发光值的影响 b.BSA的影响有些BSA中可能含有杂质，导致本底高，建议更换BSA或采用我公司BSA替代蛋白；c.采用不同厂家发光液在同样的系统中做对比。
介绍ELISA试剂盒中常见的三种HRP底物
介绍ELISA试剂盒中常见的三种HRP底物ELISA试剂盒中HRP底物范围较广，主要包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
一、二氨基联苯胺／金属盐DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。
它产生剧烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。
多数状况下，推举在DAB中加入不同的金属离子。
当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。
此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。
DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。
1. 需要的溶液和特别设备DAB，0.05 mol／LTris缓冲液(pH7.6),0.3％ (W/V) 氯化镍/水贮存液,30％过氧化氢,DPX,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).2. 操作步骤(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris缓冲液(pH7.6)溶解6 mg DAB；(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢。
过氧化氢一般以30％的溶液供应，贮存在4 ℃，此条件可以持续1个月；(4) 假如消失沉淀，用滤纸过滤；(5) 加此溶液至标本，并孵育1~20 min水洗终止反应；(6) 优化：假如需要可复染；(7) 用DPX封片。
二、氯萘酚氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。
敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。
它适用于当DAB反应形成较高背景或要求转变产物的颜色。
1. 需要的溶液和特别设备0.03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，过氧化氢，Gelvatol或者Mowiol，光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2. 操作步骤(1) 氯萘酚贮存液的预备：用10 mL无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，贮存于-20℃；(2) 加100μL 氯萘酚贮存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢于水中。
HRP基础知识.doc
酶标记物是免疫酶技术中的关键试剂。
由于具备易于提取、价格实惠、性质稳定等优点, HRP已成为elisa实验屮应用最广泛的标记酶。
由于HRP在辣根屮含暈很高，因为又称为辣根过氧化物酶。
HRP是一种分了蜃达44 000的糖蛋门，由无色的酶蛋片和深棕色的铁吓咻结合而成，中性糖和氨基糖约占18%,主耍有U•露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。
每一个HRP分子中含一个氯化血红索IX作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波氏处冇故大吸收。
HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl) 值。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量,并非表示HRP制剂的真正纯度,而且RZ 值鬲的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。
但町以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1%(W/V)酶溶液吸光度为22.5,浓度为227umol/L]0纯HRP干燥贮存于-20oC可保持稳定，使用1.36 mol/L甘汕、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使齣结合物稳定数年。
HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或10%甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。
貳化物或硫化物在10-5〜10-6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用触化物、叠氮化合物或轻胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP;HRP还町被轻甲基过氧化@不可逆地抑制。
强酸也是HRP的强烈的抑制剂。
因此，在酶免疫测定常选川上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。
此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。
HRP的同工酚主要可分为三种类型：①禽糊最高的酸性同工酶。
②等电点接近于屮性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。
HRP基础知识
酶标记物是免疫酶技术中的关键试剂。
由于具备易于提取、价格实惠、性质稳定等优点，HRP已成为elisa实验中应用最广泛的标记酶。
由于HRP在辣根中含量很高，因为又称为辣根过氧化物酶。
HRP是一种分子量达44 000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，中性糖和氨基糖约占18%，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。
每一个HRP分子中含一个氯化血红素IX作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有最大吸收。
HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl)值。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ 值高的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。
但可以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1%(W/V)酶溶液吸光度为22.5，浓度为227umol/L]。
纯HRP干燥贮存于–20oC可保持稳定，使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。
HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。
氰化物或硫化物在10–5～10–6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用;氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP;HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。
强酸也是HRP的强烈的抑制剂。
因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。
此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。
HRP的同工酶主要可分为三种类型：①含糖量高的酸性同工酶。
②等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。
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HRP底物分类
底物范围较广，包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
二氨基联苯胺／金属盐
DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。
它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。
多数情况下，推荐在DAB中加入不同的金属离子。
当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。
此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。
DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。
1．需要的溶液和特殊设备
DAB，0．05mol／LTris缓冲液(pH7．6)；
0．3％(W／V)氯化镍／水贮存液；
30％过氧化氢；
DPX。
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)
2．操作步骤
(1)用9ml 0．05mol／L Tris缓冲液(pH7．6)溶解6mgDAB；
(2)加lml 0．3％(W／V)氯化镍／水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；
(3)加0．1 m1 3％过氧化氢。
过氧化氢一般以30％的溶液提供，贮存在4E，此条件可以持续1个月；
(4)如果出现沉淀，用滤纸过滤；
(5)加此溶液至标本，并孵育1—20min水洗终止反应；
(6)优化：如果需要可复染；
(7)用DPX封片。
氯萘酚
氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。
敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。
它适用于当DAB反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。
1.需要的溶液和特殊设备
0，03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0．05mol／
LTris(pH7．6)
过氧化氢；
Gelvatol或者Mowiol。
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2．操作步骤
(1)氯萘酚贮存液的准备：用10ml无水乙醇溶解0．3g氯萘酚，贮存于—20℃；
(2)加100ul氯萘酚贮存液至10ml 0．05mol／LTris(pH7．6)，
(3)加0．1ml 3％过氧化氢于水中。
过氧化氢一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1个月；
(4)白色沉淀可用滤纸过滤去除；
(5)加此溶液到标本中，并在室温孵育10～40min，水洗终止反应；
(6)优化：如果需要，进行复染，但只可使用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或者Mowiol封片。
氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)产生红色产物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB 反应产生较高背景或要求改变产物颜色的试验。
此产物可溶于醇，但不溶于水。
1．需要的溶液和特殊设备
0．4％AEC用N，N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
0．1mol／L乙酸钠缓冲液(pH5．2)；
过氧化氢；
Gelvatol或Mowi01．
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2．操作步骤
(1)用lmlDMF溶解4mgAEC。
AEC在DMF中稳定，因此，可以用
100mlDMF溶解0．4gAEC作为贮存液备用；
(2)加lmlAEC溶液至15ml 0．1mol／L的乙酸钠缓冲液(pH5．2)中，并搅拌；
(3)加0．15ml 3％过氧化氢于水中。
过氧化氢一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1个月；
(4)用滤纸过滤；
(5)加此溶液到标本中，并于室温孵育10～40min，水洗终止反应；
(6)优化：如果需要复染，只可用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或Mowiol封片。