土壤放线菌分离提纯
从土壤中分离放线菌
从土壤中分离放线菌
从土壤中分离放线菌
?制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
?称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴或重铬酸钾(50mg,L)，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
可以稀释到更高的倍数。
?用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25,30?温箱中，培养7,10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
?挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上
采用平板涂抹分离法研究了培养基类型及样品处理对高寒草甸土壤中放线菌分离效果的影响。
结果表明:高氏1号加重铬酸钾(50mg,L)培养基是较好的分离培养基。
土样在120?于热处理1h后其悬浮液加0.05,SDS(十二烷基磺酸钠)和6,酵母膏，40?振荡30min，能促进放线菌孢子萌发，增加放线菌的分离数量。
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌2、放线菌的培养3、放线菌的发酵产生活性物质4、放线菌产生的活性物质提取。
实验原理：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。
许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。
采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。
产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。
实验器材：1、土壤2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。
实验步骤：一、土壤放线菌株的采集采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
样品（土壤）处理：室温风干二、土壤中放线菌的分离、培养1、配制淀粉培养基淀粉琼脂培养基（高氏培养基）可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。
加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。
调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。
2、土壤悬液梯度稀释①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。
②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。
③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。
土壤分离提纯方案
土壤放线菌的分离提纯土壤中的细菌多种多样，在无菌操作的基础上，利用土壤溶液在培养基上培养微生物，通过对放线菌的基本特征鉴定，再进行画线分离纯化的操作，最后利用染色法在显微镜下观察菌体的形态。
通过理论的知识解决实践中的问题，提高实验能力，达到实验的目的。
一、实验目的1.学会选择放线菌采样点并合理取样；2.掌握高氏一号培养基的配制方法；3.学习分离纯化放线菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术，学会放线菌纯培养的确定；4.学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备；5.培养并学习微生物实验的一般思维及方法。
二、实验原理放线菌是指能形成分枝或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，主要的分布源是土壤，链霉菌是其优势菌群。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一类微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物（本实验不采用添加抑制剂）。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
因此，根据微生物的生长习性及所需的营养元素而配制不同的培养基。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
需要指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，最好再结合显微镜检测孢子生长状况及个体形态特征。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性分布的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
本实验将采用高氏1号培养基从土壤中分离放线菌。
三、实验器材1. 培养基的配制：放线菌的选择性分离实质上式处理目的菌株与非目的菌株的关系，要使培养基的设计尽可能具有选择性，有利于目的菌株的生长，而抑制非目的菌株的繁殖。
实验二-----土壤中放线菌的分离
实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5～10cm的土壤后取样.放入100ml三角瓶中,加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24—48h，液面则产生黄白色皮膜。
用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28—37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。
实验6土壤中放线菌的分离（实训）实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法.2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。
3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。
4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术.实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。
其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。
实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基.这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
分离放线菌常用稀释倒平板法。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理(120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌.再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离
分离土壤中的放线菌的步骤如下：
1. 准备培养基：选择适合放线菌生长的培养基，常用的包括土壤提取物富集培养基、葡萄糖琼脂糖培养基、镜菌素琼脂糖培养基等。
2. 取样：在选择好的采样地点，使用消毒的工具（如消毒棉签或无菌铲子）采集土壤样品。
注意避免土壤样品的污染。
3. 预处理：将采集到的土壤样品放入无菌研钵中，加入合适的无菌生理盐水或者缓冲液，悬浮土壤样品，使放线菌被更好地释放出来。
可以对土壤样品进行稀释处理，以降低微生物密度。
4. 稀释平板法：将预处理好的土壤样品用无菌移液管分别
在培养基平板上均匀涂布。
然后放入恒温培养箱进行培养。
孵育时间一般为3-4周。
在培养箱内，放线菌会产生菌落
形成。
5. 单菌分离：在培养箱内观察到单个的放线菌菌落后，使
用消毒的工具将其分离到新的培养基上，形成纯种菌落。
这一步可以采用传统的传代分离法或微量分离法。
6. 纯种菌株保存：将得到的纯种菌株存储在适当的冻存管中，通过冻存进行长期保存。
需要注意的是，在进行上述步骤时，需要严格遵守无菌操
作的原则，避免样品或培养基的污染，以保证得到纯种的
放线菌菌株。
放线菌的分离
实验五：土壤中放线菌的分离实验学时：5学时实验类型：验证性实验、综合性实验实验要求：必修一、实验目的从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。
通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。
但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。
用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。
首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。
常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。
其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。
四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
土壤中放线菌的分离 (2)
土壤中放线菌的分离简介放线菌（Actinomycetes）是一类广泛存在于地球各种土壤中的微生物，具有丰富的生物活性代谢产物和生物学功能。
分离土壤中的放线菌对于获得新的生物活性物质和解析放线菌菌株有着重要意义。
本文将介绍土壤中放线菌的分离方法及过程，并提供一些实践经验。
分离方法样品收集选择合适的样品收集地点至关重要。
一般情况下，草地、农田、果园等土壤中含有较丰富的放线菌资源。
在进行样品收集前，应先清理收集工具和容器，并使用无菌绳固定收集区域，避免外界杂质污染。
样品处理1.从采集的土壤中取得样品，并将其放入无菌锥形瓶中。
2.将样品添加至无菌水中，形成土壤悬浮液。
可以通过搅拌或振荡等方式充分悬浮土壤颗粒。
3.通过离心的方法，去除悬浮液中的大颗粒和杂质。
分离培养基的制备分离出放线菌的选择培养基非常重要，一般常用的培养基有：•考马斯琼脂培养基（Koj A）•聚芽孢杆菌琼脂培养基（SGA）•苯丁三唑糖脂琼脂培养基（BIS）其中，考马斯琼脂培养基是最为常用的一种，可以选择性地培养出放线菌。
分离操作1.在无菌条件下，将处理好的土壤悬浮液均匀涂布于分离培养基上。
2.用一次性平皿、玻璃块或玻璃棍等工具均匀划开土壤悬浮液，以增加放线菌的分离点。
3.培养皿密封后，放入恒温培养箱进行培养，通常在28-30℃下培养7-10天。
鉴定和筛选在培养箱中培养的结果显示出放线菌的单独菌落后，可以进行以下鉴定和筛选步骤：1.观察和记录菌落形态特征，包括颜色、形状、质地等。
2.进行显微镜下的形态观察，例如菌丝形态、芽孢形态等。
3.进行生理生化特性的鉴定，包括酶活性、产生代谢产物等。
4.进行16S rRNA或其它分子生物学方法的鉴定，以确定放线菌属别。
实践经验1.分离培养基的配制需要细心严谨，避免污染。
最好在无菌工作台环境下操作。
2.鉴定放线菌时，不同菌株之间可能存在形态和生理差异，需要谨慎观察和鉴定。
3.放线菌培养需要一定的时间，早期菌落的筛选和鉴定需耐心等待。
实验四、土壤中放线菌的分离
实验四、土壤中放线菌的分离一、实验目的1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。
通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。
但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。
用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。
首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。
常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。
其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。
图1 稀释涂平板法示意图四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
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1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作
技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检 测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法
实验材料
药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、
4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂、重铬酸钾
其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量
筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、 无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅 笔。
实验原理
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），
其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土 壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体， 为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离 出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。 根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮 培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h）， 或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现 的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在 固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球 菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学 成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为 可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O 作 为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成
加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断 搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟。
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2. 土壤中放线菌的分离
1．将6套平皿、12只试管灭菌，编号，分装：取6套无菌平皿，
在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。 每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至 50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。 另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上， 依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀释倾注分离 称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液， 静置30s。 用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的 无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面， 使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀 释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。如图→
实验步骤
1.高氏一号合成培养基的制备
2. 土壤中放线菌的分离
1.高氏一号合成培养基的制备
K2HPO4 •3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25,
MgSO4•7H2O0.125g， FeSO4•7H2O 0.025g，氯化钠 0.125g，琼脂5g，水250ml。
配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，
拮抗实验
长出菌落后，要判断是否已分离到了纯菌种。 1.配置鉴别培养基
配置金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养基。
2.标号
在两平板上标注均匀间隔的7个区域。
3.挑菌落
在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落依次放入标注 区域中（在火焰旁切取），置于28℃恒温箱培养1天后可观察到 有抑菌圈生成。
3．倒平板分离培养于上述盛有不同稀释度菌液 的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏 培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀， 待凝固。（若融化的培养基温度太高，会产生太 多的冷凝水，影响观察。） 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6 的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中， 每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度 小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。 稀释涂布平板法 4.培养 接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温 箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌） 菌落。
菌种纯化
1、倒平板 将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。 2、平板划线 划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品 在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： ⑴分区划线 用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火 焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁刮取少许 菌苔，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约 70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线， 然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面 成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。 划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 ⑵连续划线 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线 完毕后，盖上皿盖，倒置28℃培养。