免疫组化试剂的正确使用
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法（SP法、Elivison二步法、ABC法）一、Elivison二步法1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
2、取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS 冲洗2×3’。
（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3×3’。
4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
5、PBS冲洗3×5’。
除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。
PBS冲洗3×3’。
6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。
PBS冲洗3×5’。
7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。
8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
二、SP法SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
主要试剂的配置（1） PBS缓冲液NaCl g磷酸氢二钠 g磷酸二氢钠 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）L柠檬酸盐溶液（PH ）A液：柠檬酸溶液(4℃保存)柠檬酸1000mlddH2OB液：柠檬酸钠溶液(4℃保存)柠檬酸钠1000mlddH2O900ml dH2O 缓冲液现用现配（1000ml mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)充分混合，调整PH ，充分混合，调整PH （3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)%Triton的配制Triton原液 ml液4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清 50µl%Triton 950µl4℃保存。
免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ 5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中）。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程操作流程：1、脱蜡和水化脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤30-90分钟。
（1）置于二甲苯 I中浸泡 10分钟，在二甲苯I I中再浸泡 10分钟；（2）无水乙醇 I中浸泡5分钟，在无水乙醇I I中再浸泡5分钟；（3）95%乙醇中浸泡3-5分钟；（4）80%乙醇中浸泡3-5 分钟；（5）75%乙醇中浸泡3-5分钟；（6）蒸馏水中浸泡3-5分钟；2、去除内源性过氧化氢酶用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 10分钟，PBS/蒸馏水洗3次，每次3-5分钟。
3、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片（1）微波热修复：取一定量的抗原修复液于微波盒中，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档微波P-60继续处理10-20分钟；取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗3-5次，每次5分钟。
（2）酶消化方法：常用0.1% 胰蛋白酶和0.4% 胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为10-30 分钟。
4、免疫组织化学染色（1）滴加正常山羊血清封闭液，37℃，30分钟。
（2）甩去多余液体，滴加一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温30-45分钟）。
（3）PBS洗3次，每次5分钟。
（4）滴加二抗，孵育条件参见所用试剂盒。
（5）PBS洗3次，每次5分钟。
（6）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度。
（7）自来水/蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；（8）脱水、透明、封片、镜检。
操作规程1、脱蜡和水化（1）脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤1-3小时，恒温箱温度不得高于70℃，恒温箱内不得长期（超过24小时）存放物品，烤片结束后且恒温箱内没有其他切片等物品，请及时关闭恒温箱，避免恒温箱使用时间过长。
（2）使用通风橱内的二甲苯和梯度乙醇脱蜡，不得将二甲苯和梯度乙醇拿到通风橱外使用。
免疫组化标准操作程序
免疫组化标准操作程序
Elivision™plus免疫组化染色原理：Elivision™plus试剂盒将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。
一、染色步骤：
1、蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3*3分钟）。
2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3、如有必要，每张切片加1滴或50ul3%过氧化氢溶液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
PBS冲洗3*3分钟。
4、甩去PBS,每张切片加1滴或50Ul的第一抗体，室温下孵育60分钟或4。
C过夜，具体参阅各种抗体的说明书。
5、PBS冲洗3*3分钟。
6、甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul聚合物增强剂（试剂A）,室温下孵育20分钟。
7、PBS冲洗3*3分钟。
8、甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,室温下孵育30分钟。
9、PBS冲洗3*3分钟。
10、甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC 显色液，显微镜下观察3-10分钟。
11、蒸储水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。
12、如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透
明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。
二、染色结果：
镜下观察阳性显色为棕色或红色。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化(DAB试剂盒标准)
免疫组织化学技术一， 流程图： 二，详细操作：（一）制作石蜡切片（详见后面的材料）（二）脱蜡，透明，水化1）脱蜡前先60度烘片30-40;2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3缸），各15。
注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本3）梯度乙醇入水：将切片依次置入100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各5;（三）抗原修复操作：1）645s 烧开修复液(柠檬酸0.2柠檬酸三钠1.5g 蒸馏水稀释至500为6.0)2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟3）将修复液120s 再烧开4）组织再焖5分钟5）取出烧杯，使液体和组织自然冷却6）冲洗3分钟1次,0.1 10(破坏细胞膜)，冲洗3分钟1次（四）孵育操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢10， 冲脱蜡，透明，入水 抗原修复 制作石蜡切片 显色 孵育洗3分钟x3次；2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35山羊血清，室温下孵育30分钟（注意：此步操作后不用冲洗）；3）加一抗(兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好）2h，冲洗3分钟⨯ 3次；加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30—40，复温也要放在湿盒内 4）加二抗（生物素标记的羊抗兔复合物）：室温孵育10分钟，冲洗3分钟⨯ 3次；5）加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育10分钟，冲洗3分钟⨯ 3次；（五）显色1）染色：每个脑片35新鲜配制的显色液，室温孵育10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。
2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→溶液返蓝10-20（还可以浸泡10的纯水）3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干，观察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面）备注：1、配制：团队常用一包粉末，配制2000纯水，加6的，在7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的或者酸量不同，但是一般是一样的）2、一抗工作液，一般配制成5，0.3%的牛血清（0.15g），5%的羊血清（250），余加纯水3、一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的4、：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的部分，防止误差5、用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完。
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免疫组化试剂的选择
一抗的正确选择与使用
1. 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。
2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。
加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。
3. 跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。
对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。
4. 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。
但由于供应商质捡所用组织不同，实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己再重新选择比例。
一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释。
5. 保存：一抗体一般为液体
二抗的正确选择与使用
1. 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。
一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。
目前，美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠Ig的封闭液，可以得到清晰的染色背景。
2. 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。
如一抗是小鼠IgG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。
3. 正确使用：也需要重新选择稀释比例。
一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。
检测系统的正确选择
检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统：亲和素－生物素放大系统很常用，但由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经典的SP、SRABC和LSAB法等常出现背景着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。
Zymed公司研发的非生物素放大试剂盒NAB和 Picture Plus试剂盒，采用多聚氨基酸支架偶联多个抗体和酶、荧光素等信号检测分子起到良好的放大效果，具有高敏、背景清晰等优点。
对于啮齿动物组织的免疫化学检测：由于啮齿动物非特异性结合强，最好选用美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒。
设立阳性对照和阴性对照
实验设立对照是证明实验系统正确性的标尺，为查找实验原因提供重要线索。
1. 阳性对照的选择：阳性对照是证明整个实验体系正确的重要依据，主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。
尤其在结果出现无信号时，为查找原因的提供重要线索。
具体选择方法请参阅抗原修复有关章节。
2. 阴性对照的选择：有两种：一种是自身对照，指测试组织本身非抗原表达部位。
一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织。
设置阴性对照表明检测抗原特异性和非抗原表达部位的非特异性结合。
一般自身对照比较常用，在同一张测试片上作，减少了操作误差，对照更可靠。
试剂保存
抗体试剂保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。
-抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，－20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－8℃可以保存一个月。
（请参阅免疫组化基础知识有关章节。
）
试剂盒保存：完整试剂盒未打开前于2－8℃可以保存一年，打开后，应根据说明书要求对具体试剂进行适当存放。
一般标准品应放置－20℃，用不完的抗体试剂应小量分装－20℃保存。
免疫组化常见问题分析及处理方法详见第十二章。