ENA检测
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临床免疫学：免疫印迹法检测ENA抗体 (2)
TMB见光易分解，应避光保存
AP的 底物
酶和酶作用底物
常用底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞基β-D半 酶作用后，生成高强度 乳糖苷（ 4MUG ） 荧光物 ，用荧光计测量。
二、酶标记物
酶免疫技术的核心组成部分
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
➢ 应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
双抗夹心法检测原理示意图
双抗体夹心法特点：
※非竞争结合反应 ※常用于抗原的检测 ※适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的 多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 ※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的 不同抗原决定簇
免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原如药物的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后标记酶的活性会发生改变不用分离结合和游离酶标记物通过测定标记酶的活性的改变而确定抗原或抗体的含量
小结
• 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗 原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体 的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高 敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免 疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结 合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。
酶免疫技术
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
抗核抗体检测的质量要求及结果的合理判读-精选文档
自身免疫病的“病谱”
器官特异性
非器官特异性
桥本甲状腺炎 扩张性心肌炎
自身免疫性溶血性贫血 系统性红斑狼疮
原发性粘液水肿 恶性贫血
特发性血小板减少性紫癜 干燥综合征
甲状腺机能亢进 自身免疫性胃炎
特发性粒细胞减少症
类风湿关节炎
Addisino病 1型糖尿病 重症肌无力
自身免疫性肝炎 原发性胆汁性肝硬化 原发性硬化性胆管炎
抗核膜抗体(抗板层素抗体)
荧光模式: 在核膜区呈现线状荧光, 中心区域荧光强度弱(Hep2), 而肝细胞片:中心区域发暗,无荧光, 此点可与核均 质荧光相区别. 靶抗原: 包括60kD, 68kD和74kD 3种蛋白组分,与中间丝相关, 以网状形式包被在核内膜的内部. 相关疾病: 慢性活动性自身免疫性肝炎的活动期.
每个实验室应根据各自情况，建立本室的cutoff值，以确保实验结果的精确性和可比性
部分自身抗体的国际参考品
参考品
特异性
WHO Wo80 dsDNA 100 IU/ampoule
WHO1064
均质型ANA 100 IU/ampoule
MRC 参考品A 均质型ANA 100 IU/ampoule
患病率↓： PPV↓ ，NPV↑ 理想的ANA试验： 高PPV：大部分阳性结果者是CTD患者 高NPV：大部分阴性结果者不患CTD
ANA检测的选择原则
临床医生选择ANA检测的目的： 1）在有典型症状患者中作出CTD的诊断 2）在症状不确定患者中排除CTD的诊断 3）明确CTD的类别 4）判断病情活动度
EUROIMMUN
粗颗粒型 抗RNP/Sm抗体
荧光模式:
§ Hep-2细胞:间期时,整个细胞核呈现粗颗粒,但有 时也出现中等到细的颗粒荧光,核仁为阴性;在分裂 期细胞中,浓缩的染色体部位为阴性,而外周区几乎 为均质型、光滑的荧光.
临床免疫学：免疫印迹法检测ENA抗体
实验步骤
1. 配制工作液：按1：10的比例稀释浓缩液.（10 ml ）； 2. 向每一反应槽孔加入0.5ml工作液和1份测试条，温
育1～2分钟； 3. 向每一反应槽孔加入待测血清10μl，充分混匀，
摇床上反应30分钟； 4. 弃去槽内液体，加入1ml工作液，洗涤1分钟，重
复洗涤4次； 5. 加入0.5ml工作液，酶标二抗20μl，充分混匀，摇床
注意事项
1. 标本溶血、黄疸、高血脂； 2. 试剂盒使用前恢复至室温； 3. 取测试条时防止损坏膜上抗原。
思考题
1. 自身抗体、ANA、ENA、抗ENA抗体的 联系和区别？
免疫印迹法检测ENA抗体
实验目的
掌握免疫印迹方法的基本原理、检测 ENA抗体的基本操作方法；
自身抗体的其它检测方法和相关的临 床意义。
实验原理
酶免疫印迹 抗原SDS-PAGE电泳/转膜 （点膜）
免疫反应（加一抗/二抗）
显色
试剂和器材
1.待测标本； 2.检测用膜载体； 3.浓缩液； 4.酶标二抗； 5.显色底物A/B； 6.终止液。
上反应30分钟； 6. 同第3步洗涤； 7. 加入显色液A/B各0.5ml，室温反应10分钟； 8. 每槽加入终止液0.5 ml，混匀，1分钟后弃去槽内
液体，用蒸馏水洗涤3次； 9. 取出测试条，自然干燥后进行结果判定。
Байду номын сангаас
结果判断
1. 测试条蓝线与标准谱带“0”线对齐； 2. 测试条蓝线下方的第一条区带为质控线； 3. 带型分析。
免疫印迹技术ANA谱测定
免疫印迹技术ANA谱测定
罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。Fra bibliotek影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。Fra bibliotek影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
自身免疫性疾病的实验室检测
• 最多18种抗原 • 自动化操作 • 全自动化结果判读
抗ENA抗体的临床意义
1、抗Sm抗体 SLE的标志性抗体，30%--40%SLE患者抗
Sm抗体 阳性，不与SLE的活动性有关。抗Sm 抗体 对早期、不典型的SLE诊断意义较大。
2.抗核RNP(nRNP)抗体 MCTD的重要血清学依据，检出率大
自身抗体的特性
自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体（谱） 是自身免疫性疾病的重要标志 与疾病的活动性相关 参与免疫病理性损伤。
自身抗体的临床意义
AID诊断与鉴别诊断 AID 病情评估与治疗监测 AID病程转归与预后判断 AID致病机制的研究
常检测的自身抗体
• 抗核抗体（ANA） • 抗可提取性核抗原抗体（ENA） • 抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA） • 类风湿因子（RF） • 抗角蛋白抗体（AKA） • 抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体） • 抗心磷脂抗体（ACLA）
检检测测方方法法及及应应用用
• 间接免疫荧光检测：检测抗dsDNA抗体最特
异和最敏感的方法是用马疫锥虫或绿蝇短膜虫作 为抗原基质进行间接免疫荧光检测，是目前国内 外临床常规检测抗dsDNA抗体最常用的方法。 • 抗dsDNA抗体诊断SLE的特异性可达95%～100%， 但其敏感性仅为30%～50%，因此抗dsDNA抗体阴 性不能排除SLE的诊断。
内分泌性疾病 血液系统疾病 循环系统疾病
按器官特异性分为两类
系统性自身免疫病 (systemic autoimmune disease)或器官非特异性或全身性自身免疫病
器官特异性自身免疫病 (organ-specific
autoimmune disease)或局限性自身免疫病
自身免疫性疾病的共同特征
ENA检测
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验步骤六： 实验步骤六：加样
将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的 每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可 加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。 为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加 样板的反应区中。 加样体积: 20 µl/反应区(5 x 5 mm)
P3
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验原理： 实验原理：
P4
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验步骤： 实验步骤：
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验步骤八： 实验步骤八：加样
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装 PBS-Tween 有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷 酸盐缓冲液中加10滴(150 µl)伊文氏蓝进行复染。 冲洗1秒钟 小杯内浸洗5分钟
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验步骤十： 实验步骤十：结果判断
荧光显微镜下观察荧光。
B
间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
ENA抗体谱的临床意义
ENA抗体谱的临床意义
一、背景知识
CRP的全称是C Reactive Protein，能通过血清学定量检测及分析，是一种用来诊断急性炎症状况的重要指标，也是一种有效而直接反映炎症状况的抗原。
由于CRP的积累和血清浓度的增加，可以清楚地反映炎症发生的状况，这也是CRP被广泛用作衡量炎症的重要指标之一
IL-6（白细胞介素-6）是一种炎症抗原，可以反映与免疫反应所发生的各种炎症反应有关的变化。
IL-6可以用来诊断与炎症反应有关的各种疾病，因此也是一种常用的反映炎症状况的抗原。
TNF-α（肿瘤坏死因子-α）是一种多功能的细胞因子，它包括调节免疫反应以及抗炎症的作用，可以参与炎症反应。
由于TNF-α与炎症的发生和维持有关，因此在临床上，TNF-α测定常被用来反映与炎症相关的疾病的严重性。
ENA是Extra-Nuclear Antigens（外核抗原）的简称，是一类重要的抗原，通过ENA抗体水平的检测，能够清楚地显示出患者患其中一种炎症性疾病的程度。
CRP作为炎症抗原在临床上的使用比较广泛，其主要用途是用于诊断急性炎症状况，尤其是用于诊断急性炎症性疾病。
慎重看待ENA多肽抗体的临床意义
总之，虽然多肽抗体检测可以测出与某种抗原反应的多肽的分子量，但不等于与该分子量反 应的条带即为某种特异的抗体。实验检测应客观地报告与某种分子量反应的条带，而绝不能 只要有条带出现即报告某种抗体阳性。不论检验人员还是风湿免疫科医师，均应正确看待多肽抗体检测的临床意义。IB法所采用的未经纯化的兔胸腺抗原中有不同的蛋白质，虽然这些蛋白质分子量不同，但由于其带电荷不同，在电场中泳动速度仍可相同，从而使不同分子量的蛋白质出现电泳距离一致的条带。因此分子量相同的条带并不一定显示为抗某种单一蛋白的抗体。另一方面，IB法中的抗原是经过变性的，即使有些抗体可能识别转移膜上的变性抗原决定簇，但并非所有抗体均能与变性抗原决定簇反映，故IB法并非高度敏感。IB法另一个缺点是只能定性，不能定量， 这对要求有高滴度的抗u1RNP才能诊为MCTD不利。至今国际上检测抗ENA抗体主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)，但很多医院仍在采用经典的免疫双扩散法和电泳法。ELISA法必须要有高度纯化的抗原，国外已有试验盒出售，但价格高。基因重组抗原虽然纯度高，但也可能因表达细菌的产物，仍会出现非特异性反应；另外重组抗原蛋白可能缺乏表达后修饰，其高级结构与相应天然蛋白质的不同，也可出现假阴性。放射免疫沉淀法由于其复杂性不适合临床常规。我们认为，国内目前普遍采用的IB法检测ENA多肽抗体尚欠可靠，仅凭一条条带即报告某一抗体阳性应非常慎重，有必要结合其他方法，如双扩散、电泳法或ELISA加以验证。不论采用何种方法，临床医师在对实验结果作出正确判断之前，要除外假阳性和假阴性。我们必须面对病人，任何时候不能只抓住一点，不及其余；不能孤立地看待某项异常结果，而要将其置于病情中全面衡量，以免本末倒置，这是临床医疗 中必须时刻遵循的原则。
IB是将可溶性核抗原(ENA)置于电场中，经浓缩分离后，转印在硝酸纤维膜上，然后该膜被 加上病人血清，进行抗原—抗体反应。再经过酶标抗体和底物作用，显示出多肽抗体条带。 与标准分子量比较，可以了解ENA中被特异性抗体所识别的相应抗原决定簇的分子量。这一 方法的优点是能利用某种特定分子量的蛋白质抗原进行特异性抗体的检测。以恒佳公司试剂 盒为例，抗Sm出现抗28 000、29 000和13 500三条带；抗u1RNP为抗73 000、32 00 0和17 500三条带；抗SS-A为抗52 000条带；抗SS-B为抗48 000、47 000和45 00 0三条带；抗Jo-1为抗55 000条带；抗Scl-70为抗86 000和70 000两条带；抗r RNP为抗38 000、16 000和15 500三条带。问题的关键是当出现三条带中的一条带或两条带能否报告为某种特 定抗体。举Sm抗体为例，如果认为29 000、28 000、13 500三条带同时出现即为抗Sm抗 体阳性，那么当仅有29 000和(或)28 000们曾遇到外地转京求治的“SLE”患儿，病初发热，因给予氨苄青霉素而过敏 出现皮疹、关节痛，被疑为“SLE”，当时检测ANA阴性，而多肽抗体中抗13 500阳性，被视 为抗Sm阳性，即用大量激素进行“正规”治疗，导致激素的严重不良反应。家长带患儿辗转 南北，不仅造成了极大的经济损失，而且严重影响了患儿的身心健康。我们对198例抗29 00 0、28 000和13 500三条带均阳性的病人进行临床分析后发现，其中21例不能诊断为SLE ，198例血清再以高特异性的免疫双扩散检测，其中156例抗Sm阳性，两者符合率为92%；对1 48例仅有抗29 000和(或)28 000的病例临床分析后发现，其中83例并不能诊为SLE，再 将这些血清进行双扩散检测，仅4例为抗Sm抗体，而50%则显示为抗u1RNP抗体。这支持抗 29 000、28 000可能与抗u1RNP发生交叉，并非是抗Sm抗体的标记条带；即使有对抗S m抗体诊断较为特异的13 500出现，也并不能100%认为抗Sm抗体阳性。SLE的诊断必须密切结 合临床。我们还对u1RNP抗体中的7种不同排列组合(17 500，32 000，73 000， 32 000和17 500，17 500和73 000，32 000和73 000，73 000、32 000和17 500) 的血清与免疫双扩散对照发现，73 000、32 000和17 500三条带同时出现时与免疫双扩 散的符合率为85%。其他组合与免疫双扩散的符合率均低于50%，尤其仅抗32 000更应慎 报抗u1RNP抗体阳性。大部分抗32 000阳性病人，临床上并非为结缔组织病。再如抗J o-1抗体，被视为P M/DM的标记抗体，在多肽抗体检测中，抗Jo-1抗体显示为抗55 000条带，那么是否抗5 5 000即为抗Jo-1抗体呢?我们分析了20例抗55 000阳性的病人，仅7例临床上符合PM，其余 的13例中，有7例为未分化结缔组织病，6例为非结缔组织病(其中3例为肿瘤)。相反20例免 疫双扩散抗Jo-1抗体阳性的病人，17例为PM/DM，其余3例均为未分化结缔组织病。这表明 免疫双扩散检测出的抗Jo-1对PM/DM诊断特异性远较IB法高。同样仅52 000抗体也并非是抗 SS-A阳性。在130例抗52 000阳性的病例中37%(50/130)为非结缔组织病，而且在正常健康 人中也可有抗52 000阳性。今年5月在上海召开的华夏风湿病大会，上海仁济医院对上 海地区血清交流质控评估后指出：IB法对判断抗Sm有误，仅29 000、28 000不足以判断抗Sm 阳性，而13 500则是判断抗Sm的必要条件；对于52 000应结合对流电泳(CIE)来判断是否为 抗SS-A阳性；抗SS-B(48 000、47 000、45 000)不会单独出现，必伴抗SS-A(52 000)一起出现；抗u1RNP(70 000、32 000、17 500以及29 000/28 000)的不同 组合，应结合CIE综合判断；抗核糖体蛋白中三条多肽带(38 000、16 500、15 000)常 同时出现；对于国际上尚未公认的显色条带不应予以出具检验报告。我们同意这些看法。
IB是将可溶性核抗原(ENA)置于电场中，经浓缩分离后，转印在硝酸纤维膜上，然后该膜被 加上病人血清，进行抗原—抗体反应。再经过酶标抗体和底物作用，显示出多肽抗体条带。 与标准分子量比较，可以了解ENA中被特异性抗体所识别的相应抗原决定簇的分子量。这一 方法的优点是能利用某种特定分子量的蛋白质抗原进行特异性抗体的检测。以恒佳公司试剂 盒为例，抗Sm出现抗28 000、29 000和13 500三条带；抗u1RNP为抗73 000、32 00 0和17 500三条带；抗SS-A为抗52 000条带；抗SS-B为抗48 000、47 000和45 00 0三条带；抗Jo-1为抗55 000条带；抗Scl-70为抗86 000和70 000两条带；抗r RNP为抗38 000、16 000和15 500三条带。问题的关键是当出现三条带中的一条带或两条带能否报告为某种特 定抗体。举Sm抗体为例，如果认为29 000、28 000、13 500三条带同时出现即为抗Sm抗 体阳性，那么当仅有29 000和(或)28 000们曾遇到外地转京求治的“SLE”患儿，病初发热，因给予氨苄青霉素而过敏 出现皮疹、关节痛，被疑为“SLE”，当时检测ANA阴性，而多肽抗体中抗13 500阳性，被视 为抗Sm阳性，即用大量激素进行“正规”治疗，导致激素的严重不良反应。家长带患儿辗转 南北，不仅造成了极大的经济损失，而且严重影响了患儿的身心健康。我们对198例抗29 00 0、28 000和13 500三条带均阳性的病人进行临床分析后发现，其中21例不能诊断为SLE ，198例血清再以高特异性的免疫双扩散检测，其中156例抗Sm阳性，两者符合率为92%；对1 48例仅有抗29 000和(或)28 000的病例临床分析后发现，其中83例并不能诊为SLE，再 将这些血清进行双扩散检测，仅4例为抗Sm抗体，而50%则显示为抗u1RNP抗体。这支持抗 29 000、28 000可能与抗u1RNP发生交叉，并非是抗Sm抗体的标记条带；即使有对抗S m抗体诊断较为特异的13 500出现，也并不能100%认为抗Sm抗体阳性。SLE的诊断必须密切结 合临床。我们还对u1RNP抗体中的7种不同排列组合(17 500，32 000，73 000， 32 000和17 500，17 500和73 000，32 000和73 000，73 000、32 000和17 500) 的血清与免疫双扩散对照发现，73 000、32 000和17 500三条带同时出现时与免疫双扩 散的符合率为85%。其他组合与免疫双扩散的符合率均低于50%，尤其仅抗32 000更应慎 报抗u1RNP抗体阳性。大部分抗32 000阳性病人，临床上并非为结缔组织病。再如抗J o-1抗体，被视为P M/DM的标记抗体，在多肽抗体检测中，抗Jo-1抗体显示为抗55 000条带，那么是否抗5 5 000即为抗Jo-1抗体呢?我们分析了20例抗55 000阳性的病人，仅7例临床上符合PM，其余 的13例中，有7例为未分化结缔组织病，6例为非结缔组织病(其中3例为肿瘤)。相反20例免 疫双扩散抗Jo-1抗体阳性的病人，17例为PM/DM，其余3例均为未分化结缔组织病。这表明 免疫双扩散检测出的抗Jo-1对PM/DM诊断特异性远较IB法高。同样仅52 000抗体也并非是抗 SS-A阳性。在130例抗52 000阳性的病例中37%(50/130)为非结缔组织病，而且在正常健康 人中也可有抗52 000阳性。今年5月在上海召开的华夏风湿病大会，上海仁济医院对上 海地区血清交流质控评估后指出：IB法对判断抗Sm有误，仅29 000、28 000不足以判断抗Sm 阳性，而13 500则是判断抗Sm的必要条件；对于52 000应结合对流电泳(CIE)来判断是否为 抗SS-A阳性；抗SS-B(48 000、47 000、45 000)不会单独出现，必伴抗SS-A(52 000)一起出现；抗u1RNP(70 000、32 000、17 500以及29 000/28 000)的不同 组合，应结合CIE综合判断；抗核糖体蛋白中三条多肽带(38 000、16 500、15 000)常 同时出现；对于国际上尚未公认的显色条带不应予以出具检验报告。我们同意这些看法。
ENA抗体谱的临床意义
ENA抗体谱临床意义目前，用于体外定性检测人血清或血浆中自身抗体最为广泛的是ENA抗体谱，检测方法为免疫印迹法，其检测项目包括抗nRNP、Sm、SS-A(天然SS-A和Ro-52)、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、核小体、核蛋白、核糖体P蛋白和AMA M2共有14种。
临床意义抗nRNP抗体：该抗体主要是别核心蛋白A,C及70kd的u1-nRNP。
高滴度的抗nRNP抗体是混合性结绨组织病（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率95-100%，抗体滴度与疾病活动性相关。
在15-40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出抗nRNP抗体，也见于系统性硬化症、多肌炎等。
抗Sm抗体：系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断性指标，但阳性率仅为5-10%,几乎总伴有抗nRNP抗体,一般不会单独出现。
抗SS-A抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-95%）、也见于系统性红斑狼疮（20-60%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）、类风湿性关节炎，偶见于慢性活动性肝炎。
此外，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。
该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。
抗Ro-52抗体：SS-A抗原是一种小核糖核蛋白，由一个RNA分子和两种不同的蛋白质（分子量分别为52和60kDa）组成，抗-SS-A 60 kDa蛋白的抗体对于干燥综合症和系统性红斑狼疮的特异性更高，而单独抗SS-A 52 kDa的抗体不具有疾病的特异性，并且容易与其它抗体发生交叉反应。
抗SS-B抗体：几乎仅见于干燥综合征（40-80%）和系统性红斑狼疮（10-20%）的女性患者中，男女比例为1：29。
在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。
抗Scl-70抗体：系统性硬化症分两型：弥散性和局限型。
抗Scl-70抗体见于25-75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异。
抗ena抗体谱-免疫检验
抗ENA抗体谱-免疫检验
（一）抗ENA抗体谱概述
ENA（extractable nuclear antigens）是可提取性核抗原的总称。
ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。
ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。
不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。
ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。
（二）检测方法
检测方法有多种，如免疫印迹法（immunoblotting，IBT）、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。
这里主要介绍免疫印迹技术。
免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。
其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA搜集|整理，经过SDS-PAGE电泳分成区带，然后转印至硝酸纤维膜上，将待检血清（含抗ENA抗体）加在硝酸纤维膜上，抗ENA抗体与ENA抗原结合，形成Ag-Ab复合物，加入酶标抗人IgG，形成Ag-Ab-酶标Ab复合物，然后加入底物显色。
与标准条带对比判读，可以确定不同的抗ENA抗体。
免疫印迹技术不需纯化抗原，灵敏度高，特异性强，操作简便，是广泛采用的检测抗ENA 抗体的技术。
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验原理：
生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗
原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并
可在荧光显微镜下观察。
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
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实验原理：
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
样品1 样品2 样品3 阳性对照 阴性对照
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实验步骤四：孵育
将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本 均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育 30分钟。
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结果判读：
均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；
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结果判读：
核仁型：核仁部分呈现荧光
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结果判读：
斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；
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实验原理：
生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗
原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并
可在荧光显微镜下观察。
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Thank You!
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ANA结果判断
1：100 阴性 阴性，标本中未检测到抗核抗体
1：100 阳性
微量 对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种 风湿性疾病或其他疾病 阳性 提示某种风湿病或其他疾病
1：320 阳性
滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度
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实验步骤：
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实验步骤一：准备
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸 巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或Extran MA 01（默克公 司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的Sekusept Extra （汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方 可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进 行标记。
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实验步骤二：样品准备
1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对 照血清使用前必须混匀。
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实验步骤三：加样
在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完 所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。 加样体积: 25 µl/反应区(5 x 5 mm)
实验三 间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
郑一诫 复旦大学上海医学院免疫学系 2010－12－1
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
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抗核抗体（ANA）
ANA是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分（脱氧核糖核
蛋白 DNP、DNA、可提取的核抗原ENA、RNA等）为靶抗原的
自身抗体的总称。主要是IgG、也有IgM、IgA。并无器官和种 族的特异性。
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结果判读：
胞浆型
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结果判读：
着丝点型
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结果判读：
混合型：存在两种以上的类型
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实验步骤十：结果判断
荧光显微镜下观察荧光。
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பைடு நூலகம்
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结果判读：
荧光显微镜下观察 1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
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实验步骤八：加样
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装 有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷 酸盐缓冲液中加10滴(150 µl)伊文氏蓝进行复染。 冲洗1秒钟 小杯内浸洗5分钟
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
实验步骤五：加样
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装 有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。 冲洗1秒钟 小杯内浸洗5分钟
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实验步骤六：加样
将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的 每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可 加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。 为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加 样板的反应区中。 加样体积: 20 µl/反应区(5 x 5 mm)
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实验步骤九：封片
在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBSTween 清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注 意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的 盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要， 需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。 封片体积: 10 µl/反应区(5 x 5 mm)
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间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）
上海医学院免疫学系
实验步骤七：孵育
从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸 擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下， 盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应 区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一 张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。