动物微生物及免疫学(实践教学)实验报告

四川农业大学动物微生物及免疫学（实践教学）实验报告组长：**********组员：**********二零一二年四月一、实验目的（一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。

（二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。

（三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。

二、实验用品（一）器材量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜（二）试剂及材料肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏三、实验步骤（一）培养基的制备（所有用到的器皿都已121℃高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在无菌操作台内）1、麦康凯培养基（1）组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml（2）方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。

将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。

将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。

待冷却至50 ~ 55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。

2、血清平板（1）组成：营养琼脂、牛血清（2）方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50℃时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。

注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。

3、LB培养基（1）组成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g（2）方法：在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节pH至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。

待冷却至50 ~ 55℃时，倾注平板。

4、液体培养基（在LB培养基的基础上，装入大试剂瓶中，不加琼脂，不分装）（二）病料取材在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完整性，用储物袋密封保存。

（三）细菌粗培养1、消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。

2、接种（1）在无菌操作台酒精灯旁打开用储物袋密封保存的病料，先左手持镊子右手持剪刀，把病料剪出一个小口。

（2）右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20。

左右，然后将接种环前端插入小口旋转一下后，再用划线接种的方法接种到一个血清平板上。

（3）用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、部位等标记，并将平板倒放。

以此方法，分别接种十二指肠、胃粘膜、肝脏于血清平板上，各接种2个血清平板。

3、培养：将接种好的血清平板倒扣放入37℃培养箱中，反向培养24小时。

注：划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落，且划线时接种环应尽量倾斜，以免划破培养基（后同）；待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。

（四）细菌纯培养1、菌落特征判断待粗培养的细菌培养24小时后，取出用放大镜观察记录单个小菌落的形态特征并用实验报告纸记录好，并在平板底部上做好观察标记，其形态特征包括大小、形状、菌落边缘、表面构造、隆起度、湿润度、透明度、颜色等。

2、取单个菌落进行革兰氏染色镜检（1）取干净的载玻片，用记号笔在其一面做好正反面标记，再在载玻片另一面中央滴上一小滴蒸馏水。

（2）将接种环在火焰上灭菌，待冷却后，在酒精灯旁从标记的单个小菌落中取少许细菌置于蒸馏水中混匀（同时盖好平板倒扣置于一旁），用接种环涂成直径约1.5cm的菌膜，再在酒精灯火焰上方以钟摆速度通过固定好细菌，待冷却进行染色。

（3）先滴加草酸结晶紫溶液染色1~2min，再水洗；然后滴加革兰氏碘液溶液染色1~2min，再水洗；随后滴加95%的酒精脱色30~60s，再水洗；最后滴加稀释的品红进行复染30~60s，再水洗；待干燥或吸水纸吸干后镜检。

（4）将干燥的载玻片放在1000倍油镜下，滴加一滴松柏油进行镜检，观察其形态特征，判断细菌的种属。

3、细菌接种培养（1）消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外焰对待用器械进行火焰灭菌。

（2）接种：右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20。

左右，然后将接种环插入揭开的平板口内蘸去一下镜检标记的小菌落，再用划线接种的方法接种到一个血清平板、LB平板或麦康凯平板上。

并用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、菌种、部位等标记，将平板倒放。

（3）将接种好的平板倒扣放入37℃培养箱中，反向培养24小时。

注：油镜用完后应立即清理物镜上的松柏油；划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落；待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。

（五）菌液的制备1、镜检：用革兰氏染色法在1000倍油镜下镜检，观察并记录是否为纯培养的细菌。

2、分装液体培养基：先对无菌操作台及需要使用的器械进行消毒灭菌，然后用钳子揭开一个空试剂瓶，用倾倒的方法在酒精灯旁从液体培养基大试剂瓶中分装于空试剂瓶内，并立即盖上液体培养基大试剂瓶瓶塞。

3、接种：右手持接种环，用火焰对其进行灭菌，待冷却后，取出纯培养的平板，在无菌操作台内酒精灯旁，蘸去少许细菌，左手倾斜液体培养基，将接种环，伸入液体培养基内搅动，然后取出对接种火焰环灭菌，并用灭菌的包装纸捆绑好后，用记号笔做好相应标记，置于一旁。

4、培养摇菌：将接种好的液体培养基置于水浴培养箱中培养24小时。

注：分装一个培养基就接种一个培养基，不得全部分装完后再一个一个接种。

（六）小鼠致病性实验1、保定：选择健康的青壮年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋转数周让其眩晕，然后用左手的拇指和食指捏住两耳及头部皮肤，并翻转左手，使其头部朝下，以达到内脏前移的目的。

2、接种：先用酒精棉球蘸取酒精对注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml菌液注射于小白鼠腹腔中。

3、观察：将接种的小白鼠放在适宜的环境下生活，并在鼠笼处用记号笔标记好接种时间、菌种等。

4、再培养鉴定：待小白鼠死亡后，对其进行解剖，观察其内脏病变情况，并取肝脏直接涂在相应培养基上，在适宜条件下反向培养24小时后，取菌落细菌进行镜检观察判断。

注：在注射小白鼠2小时候需要观察小白鼠是否因注射时伤害到内脏而死亡。

（七）生化试验取生化试验管将培养液用力甩在一边，在酒精灯旁再用钳子将生化试验管另一边剪断，并在酒精灯旁将纯培养的细菌用接种环接种在生化试验管培养液中，倒放固定在塑料板上，并在塑料板上用记号笔做好菌种等标记，置于37℃培养箱中培养24小时，观察生化管内的反应变化。

注：在剪断生化管时要小心，以防划破手指，且要注意不要将生化管上的标签剪掉了。

（八）药敏实验1、接种：先将无菌操作台台面及需要用的器械消毒灭菌，用钳子将菌液瓶打开，然后在酒精灯旁用接种环蘸取菌液将其均匀地接种在相应的培养基上。

2、贴片：用灭菌的镊子将各种药敏纸片小心均匀地贴于接种好的培养基上，做好相应的记录，并用记号笔在平板底部做好相应的标记，置于适宜条件培养箱中反向培养24小时，再观察测量其生长抑菌圈的直径。

注：接种完一个平板后，应立即将菌液瓶盖住；贴片时，可在一张灭菌的白纸上做好贴片位置的标记，以保持药敏纸片的均匀。

（九）实验完毕，整理器械先对各步骤的实验材料、平板、器械等进行灭菌，然后将废料等倒入指定的废料回收处，清洗并整理好各种器材（小心清洗玻璃器皿，以防损坏被划伤），并将玻璃器皿放入烘箱中以备下次使用。

四、实验结果（以十二指肠为主）1、病猪病理特征现象：有咳嗽症状，用某药后停止咳嗽，但出现拉稀现象，并在3天内死亡了30头左右，且粪便为水样，用某药以后症状消除。

有神经症状，前肢不能站立。

解剖后肺内发生病变，全身淋巴肿大，胃粘膜出血。

此猪打过猪瘟疫苗，未打过伪狂犬疫苗。

2、各菌落特征结果（血清平板培养24小时后）（1）十二指肠：呈淡黄色半透明圆形小菌落，圆突状，边缘整齐，表面扁平光滑湿润，质地粘稠；纯化后接种在麦康凯培养基上培养的细菌使麦康凯培养基变红。

（2）胃：呈淡黄或白色圆形不透明菌落，大小不一，形成菌苔，圆突状，边缘整齐，表面光滑。

（由于在短时间内形成菌苔，和镜检观察，可断定其中无致病菌，则停止了以后的实验）（3）肝脏：呈淡黄色和白色不透明的圆形小菌落，圆突状，边缘整齐，表面光滑。

（由于有两种菌落，则分别进行分离实验）3、各菌镜检特征结果（1）十二指肠分离培养细菌：为革兰染色阳性，圆形或椭圆形、呈链状排列，未发现鞭毛及芽胞。

（2）肝脏分离培养细菌A：为革兰染色阴性，单个存在的短小杆状细菌。

（3）肝脏分离培养细菌B：为革兰染色阳性，菌体呈矛头状，成双或成短链状排列。

4、小鼠接种致死性结果（1）十二指肠分离培养细菌接种：死亡（2）肝脏分离培养细菌A接种：死亡（3）肝脏分离培养细菌B接种：存活，但精神萎靡5、生化试验结果6、药敏实验结果（1）十二指肠（2）肝脏A（3）肝脏B五、结果分析讨论（一）十二指肠中细菌：经过镜检及生化试验结果分析，判定疑是粪肠球菌（二）肝脏中细菌A：由于生化试验只分解了蔗糖和乳糖，无法分析得出结果（三）肝脏中细菌B：经过镜检及生化试验结果分析，疑是肺炎链球菌（四）诊断：通过微生物学的各种实验分析可以初步断定，此猪各病症由粪肠球菌、肺炎链球菌共同引起。

（五）用药：通过对药敏试验的分析及对比，推荐用新霉素、痢利灵、复达欣、恩诺沙星等药进行疾病治疗。

（六）肝脏中细菌A无法分析得出结果原因：生化试验只分解了蔗糖和乳糖，未分解其他试剂，可能是因为在接种生化管时，接种环未冷却就蘸取细菌，而将细菌杀死，使得未将细菌接入管内。

附一：部分图片资料。