菠萝蛋白酶活力的测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。
1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。
Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（1）班泽杰摘要：本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。
实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。
关键词：菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000，等电点 9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。
菠萝蛋白酶的温度的最稳定围是55℃~65℃。
金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1 实验材料与仪器1.1实验材料与试剂1.1.1 实验材料新鲜菠萝（3个），透析袋1.1.2 实验试剂（1）盐析粗提液0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL）（2）酶活力测定试剂1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)] ，10％三氯乙酸(TCA) 1.2实验仪器和用品1.2.1实验仪器HJ-6多头磁力搅拌器：电器MC-H18S012多功能红外炉：美的生活电器制造DS-1高速组织捣碎机：标本模型厂GKC110R2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表TD5M低速离心机：湘智离心机仪器TDL-60B台式离心机：安亭科学仪器厂722型可见分光光度计：舜宇恒平科学仪器UV5100B型紫外可见分光光度计：元析仪器PL1502-S电子天平：梅特勒-托利多仪器（）BS110S分析天平赛多利斯天平BCD-539WT冰箱：海尔股份1.2.2实验用品（1）以组为单位的用品大试管18mm×200 mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2，200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋 白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果 的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是 为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影 响。需要多次实验确定所加的量，避免 反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中， 可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。 并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质 的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠 萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain）， 从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分 解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋 白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一 种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、 明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶 解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症； 它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方 法
菠萝蛋白酶的制备及活力测定
1%酪蛋白溶液（ml）
8
1
8
0
8
0
迅速摇匀，室温下静置30min
取上清液于275nm波长下测定吸光值
五、结果与讨论
1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。
(A2+A3)/2－A1
酶活性= —————————
0.15×1/100×1/10
2、洗涤与保护
（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；
（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；
四、实验步骤
1、提取
（1）取一定量的菠萝皮汁（约ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；
（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；
（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。
4、酶活测定
（1）酶液制备
取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS(磷酸盐缓冲液)定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。
（2）活性测定
取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定）
试剂
管号
1
菠萝蛋白酶的制备及其活力测定
1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。
2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。
3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。
1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。
4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。
0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。
0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。
5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。
0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。
】扩大10倍体积。
6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。
激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。
】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。
1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。
也可以用6mol的稀释。
器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。
菠萝蛋白酶的提取与活力测定
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯 化 钠 溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时 果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋 白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最 佳提取条件。
12
计算酶的比活性 • 酶的比活性 • （F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew×0.116×10） • E275——275nm处得吸光度 • Ew——每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg • 0.116——275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨酸/10ml）的吸光度 • 10——反应时间，min
•
温度范围： 50～60℃
•
作用PH值: 6.0～9.0
6
三、实验材料和试剂 1、实验材料
新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素C 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA2Na,现配现用）
工艺流程： 菠萝下脚料→压榨→汁液→去杂质→澄清液→超滤浓缩→浓缩液→降温→加有机溶
剂沉淀（ 95%乙醇）→湿酶→减压干燥→酶制品
17
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4
二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
ABCD
2. 配置反应液
将底物和缓冲液混合，加入适量的酶液，调整反应体系 。
4. 数据处理
根据测定的数据，计算酶活力并进行分析。
结果与分析
结果表示
以表格或图表形式表示测定的吸光度或荧光强度变化，以及计算得到的酶活力数据。
结果分析
根据实验结果，分析菠萝蛋白酶的活性水平，比较不同条件下酶活力的变化，探讨影响酶活性的因素 。
白酶的粗品。
பைடு நூலகம்
结果与分析
结果
通过上述实验步骤，成功制备出菠萝 蛋白酶的粗品。
分析
通过对实验结果的分析，可以得出制 备菠萝蛋白酶的最佳条件和参数，为 后续的酶活力测定和酶学性质研究提 供基础。
03
菠萝蛋白酶活力的测定
测定方法
紫外分光光度法
利用菠萝蛋白酶分解底物产生特定波长的紫外吸收， 通过测定吸光度变化计算酶活力。
感谢观看
菠萝蛋白酶的应用
01
在食品工业中，菠萝蛋白酶可用于改善食品的口感和质地，如 肉类嫩化、奶酪制造等。
02
在医药领域，菠萝蛋白酶具有抗炎、抗水肿、促进伤口愈合等
作用，可用于治疗炎症、创伤等疾病。
在农业上，菠萝蛋白酶可以作为生物农药，用于防治植物病虫
03
害。
研究目的与意义
01
菠萝蛋白酶作为一种天然的蛋 白质水解酶，具有广泛的应用 前景。
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
• 引言 • 菠萝蛋白酶的制备 • 菠萝蛋白酶活力的测定 • 结论
01
引言
菠萝蛋白酶简介
菠萝蛋白酶是一种植 物来源的蛋白水解酶， 具有高效催化蛋白质 的能力。
菠萝蛋白酶具有较广 的底物特异性，可以 水解多种蛋白质底物。
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菠萝蛋白酶活力的测定
•碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸为含有酚
羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应，利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
•（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现不同深浅的蓝色）
1、实验材料
（1）实验器材
榨汁机、电热恒温水浴锅、分析天平、紫外分光光度计等。
（2）实验试剂
1）对照样品溶液：酪氨酸溶液0.05g/L，用0.1mol/LHCl溶液配制。
2）菠萝汁：市售菠萝压榨后过滤即得。
3）菠萝汁稀释液：称取L-半胱氨酸盐酸0.53g，EDTA0.22g，分别兑少量溶解后，混合，用NaOH(0.1mol/L)调pH至4.5，加水至100mL（新鲜配制）。
4 ）底物溶液：精确称取酪蛋白0.6g ，加Na2HPO4溶液（0.005mol/L ）80mL ，用1mol/L 盐酸调pH 至7.0 ，加水至100mL （新鲜配制）。
5 ）三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸溶液1.80g ，醋酸钠2.99g ，加水少量使溶解，加冰醋酸1.98mL ，加水稀释至100mL 。
2、操作步骤
（1）供试溶液的配制
将菠萝切碎，置于榨汁机中榨汁，用4层纱布过滤，弃初滤液，取滤后菠萝汁10mL，加菠萝汁稀释液10mL，放置15min，制成供测试用液。
（2）供试液酶解后吸光度值的测定
取上述供试液1mL，置带塞试管中，于37℃预热10min后，迅速加入已经37℃预热10min的底物溶液5mL，加入起准确计时反应10min，立即加入三氯醋酸5mL终止反应，混合后过滤，滤液在275mn处以水作参照，测吸光度A。
（3 ）空白试验
取上述供试液1mL ，置带塞试管中，于37 ℃预热10min 后，迅速加入已经37 ℃预热10min 的三氯醋酸5mL ，加入起准确计时反应10min ，立即加入底物溶液5mL 终止反应，混合后过滤，滤液在275nm 处以水作参照，测吸光度A0。
（4 ）对照吸光度测定
用水作参照，测定对照品溶液在275nm 处的吸光度A S。
5 、实验结果
（五）结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁
溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。
6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。