免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原
淋巴细胞表面抗原检测-20141113硕士班
T 细胞亚群检测 采用三色标记单克隆荧光抗体标记单个核细胞悬液，用流式细胞 仪进 行检测分析，可对 T 细胞及亚群作出精确分类。
2020/4/1
T淋巴细胞检测
2020/4/1
Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用， Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前 已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应 等都与Th1/Th2 平衡有关。 建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非 常重要。 目前检测的主要方法： 酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
2020/4/1
调节T细胞(Treg细胞)也是近年来认识的一种重要的免疫调节细胞， CD4+ T细胞在TGF-β单独的诱导下则而分化成Treg细胞，分泌TGF-β并 表达Foxp3，参与免疫的调节。 Thl7是一种能产生IL-17却不产生IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞，目前的 研究证实了TGF-β和IL-6在Thl7细胞分化启动过程中的重要作用。同时 ，转录因子STAT3和RORγt，在Thl7的分化过程中也起着重要的调节作 用。
CD4细胞，作为淋巴细胞的一种，是人体中调控免疫系统最重要的枢纽细 胞，其数量能够最直接的反应人体免疫功能的状态。CD4细胞检测广泛应 用于对人体免疫功能状况的评估，有助于肿瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病 等疾病的早期发现及临床诊疗
2020/4/1
人体内的淋巴细胞在光学显微镜下的形态基本是一样的，但其功能各异 ，对 T 细胞、B 细胞和酝细胞及其有关的亚群的相应表面标志检测，藉 以判断机体的免疫水平。 一、T 淋巴细胞表面标志的检测 T 细胞表面标志 抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 T 细胞亚群检测
细胞生物学实验手册
图 1—1 血涂片的制备 5．人血涂片的制备与观察 取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数 目少，为圆形。 6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察 用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液， 染色 5 分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁 平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。 二、测微尺的使用 (一)原理 测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平 面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物 镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长 1 毫米(1000μm)，被分为 100 格，每格长度是 10 微米。 (二)方法 1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺 使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图 1—2)。 2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度
二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。 三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。 四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。 五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设
备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。 损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。 六、注意节约实验材料、药品和水、电等。 七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材 清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关 和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。 八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。 九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时１０.３７度PBS洗净，３＊５min凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
测抗原的操作方法有哪些
测抗原的操作方法有哪些
测抗原的操作方法有以下几种：
1. 免疫荧光（Immunofluorescence）：使用荧光染料标记的抗体与目标抗原反应后，在荧光显微镜下观察荧光信号。
2. 免疫组织化学（Immunohistochemistry）：利用酶标记的二抗或荧光标记的二抗与抗原结合，通过观察其催化产物或荧光信号来检测抗原的位置与定量。
3. 免疫印迹法（Western blot）：将待测抗原通过蛋白电泳分离，然后转移至膜上，再与标记有特异性抗体的二抗反应，通过检测标记物来定性和定量待测抗原。
4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：利用固相酶诱导荧光或发光来检测抗原与特异性抗体间的结合情况，从而实现对抗原的定性和定量分析。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：通过抗体与细胞表面抗原反应，利用流式细胞仪检测抗原与细胞的结合情况，实现对抗原的表达定量分析。
6. 微阵列芯片（Microarray）：将特异性抗体固定在芯片上，与抗原反应后利用荧光信号或化学染色反应等技术检测抗原与特异性抗体的结合情况。
7. 免疫电镜（Immunoelectron microscopy）：利用金标记的抗体与抗原结合，通过电镜观察金颗粒的位置来检测抗原的分布情况。
以上是常见的测抗原的操作方法，具体的选择取决于实验目的、样本类型及技术要求。
表面抗原定量
表面抗原定量表面抗原定量（SurfaceAntigenQuantitation）是一种用于检测某种特定病毒的含量的方法。
该技术可以测量病毒的表面抗原，从而获得病毒的数量，也可用于诊断病毒感染以及对病毒感染的检测。
这种技术非常重要，因为它可以以较快的速度准确地测量出病毒的数量，有助于早期发现病毒感染，同时也有助于监测病毒感染的发展。
表面抗原定量的技术原理涉及多种技术和材料的联合应用，其中包括培养物的制备技术、免疫分析技术、免疫毒球测定技术和物化技术等。
首先，从病毒样本中分离出病毒，然后将其培养到指定的培养基中，然后将它们移入免疫荧光分析板中，在这里进行免疫荧光分析，利用抗病毒抗体（antibody）、抗原（antigens）和荧光探针（fluorescent probes）之间的结合反应，测定病毒的表面抗原物质含量。
其次，如果要精确测定抗原物质的含量，可以采用免疫毒球测定技术。
通过在免疫毒球测定装置中添加抗原，抗体和毒球，可以测定抗原物质的含量。
最后，还可以采用物化技术来进行表面抗原物质的测定。
物化技术是利用物理原理进行分析的技术，可以对表面抗原物质的数量进行准确的测定。
此外，表面抗原定量技术在病毒感染诊断和控制方面也有广泛的应用，因为它可以用来发现和帮助控制病毒感染。
表面抗原定量技术可以用来测定病毒抗原含量，以确定抗原浓度，帮助医生提前发现病毒感染，并及时采取治疗措施。
此外，表面抗原定量技术还可以用于监测病毒潜伏期的发展，以及病毒感染的疗效，用来评价抗病毒药物的疗效。
最后，表面抗原定量技术在发展病毒抗体、接种疫苗、预防病毒感染、检测病毒以及治疗病毒等方面也有重要的作用。
总之，表面抗原定量技术是一种非常重要的技术，它能够准确地测定病毒的表面抗原物质的含量，有助于早期发现病毒感染，并且可以用于诊断和治疗病毒感染。
因此，表面抗原定量技术的研究和应用具有重要意义，为病毒感染的诊断和控制提供了重要技术支持。
直标抗体免疫荧光方法
直标抗体免疫荧光方法是免疫荧光技术的一种，主要用于检测细胞的表面抗原。
此方法的特点是采用已知的抗体来检查未知的抗原，通常需要使用冰冻切片技术，将病变组织如红斑狼疮、疱疹样皮炎、类天疱疮等进行冰冻切片，然后利用荧光标记的抗体与抗原发生特异结合的原理，使其呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原部位和性质。
此外，在抗体与抗原结合的过程中，需要注意细胞和抗原的保存和结构完整性，以确保抗体能够与其正确结合。
因此，在进行直标抗体免疫荧光实验时，通常需要采用适当的缓冲液和去垢剂处理细胞，以保证其结构和功能的完整性。
同时，为了提高实验的特异性和敏感性，还需要对抗体进行优化选择。
通常会通过调整抗体的稀释比例、选择合适的缓冲液和封闭液等方法来实现。
总的来说，直标抗体免疫荧光方法是一种高度特异性和敏感性的抗原检测技术，广泛应用于医学研究和临床诊断中。
但需要注意的是，该实验技术的结果易受多种因素影响，如抗体的特异性、细胞的处理方式、缓冲液和去垢剂的选择等。
因此，在进行实验时需进行严格的控制和标准化操作。
免疫荧光
• Autofluorescence
• • • Biological autofluorescence in mammalian cells due to flavin coenzymes (FAD and FMN: absorption, 450 nm; emission, 515 nm) and reduced pyridine nucleotides (NADH: absorption, 340 nm; emission, 460 nm).
select combinations of fluorochromes that will work together
• • In immunofluorescence, a single wavelength can be used to excite several fluorochromes with different Stokes shifts and thereby produce a variety of fluorescent colors as shown .
• 应用范围：
• 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多 肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、 肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类 别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免 疫学、血型鉴定等。
The two main methods of immunofluorescent labeling are direct and indirect.
Principle of Fluorescence
• 1 When an electron absorbs the energy from a photon of light it becomes “excited” and jumps to a higher, less stable energy level. • 2 The excited state does not last long The electron loses a small amount of energy as heat and the remainder of the extra energy is given off in the form of a phochrome would be a molecule with the following properties
常用的抗原抗体检测方法
常用的抗原抗体检测方法抗原抗体检测是生物医学领域中常见的技术手段，主要用于检测样品中是否含有特定的抗原或抗体。
以下是几种常用的抗原抗体检测方法：1、酶联免疫吸附法（ELISA）：这种方法利用酶作为标记物，与抗原或抗体结合，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而检测抗原或抗体的存在。
ELISA 方法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断、生物制品检测等领域广泛应用。
2、免疫荧光技术：该技术通过荧光物质标记抗原或抗体，利用荧光显微镜观察荧光信号，检测抗原或抗体的存在。
免疫荧光技术具有高灵敏度、高特异性、无放射性等优点，常用于组织切片、细胞表面抗原或抗体的检测。
3、放射免疫分析法：这种方法利用放射性同位素标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，用放射性检测器检测放射信号，从而确定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析法具有较高的灵敏度和特异性，但放射性物质可能对环境和人体健康造成影响，因此使用时需特别注意安全问题。
4、胶体金免疫层析法：该技术利用胶体金标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，利用层析原理将结合物分离并富集，再用光学仪器检测胶体金颗粒的聚集程度，从而判断抗原或抗体的存在。
胶体金免疫层析法具有简便、快速、可视化等优点，常用于临床床快速诊断和食品安全等领域。
5、化学发光免疫分析法：这种方法利用化学发光物质标记抗原或抗体，与样品中的抗原或抗体结合后，利用化学反应产生光信号，通过检测光信号的强度确定抗原或抗体的浓度。
化学发光免疫分析法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断和生物制品检测等领域应用广泛。
这些方法各有特点和使用范围，选择合适的抗原抗体检测方法要根据具体实验条件和要求而定。
同时，为保证检测结果的准确性和可靠性，操作过程中需遵循规范，避免污染和交叉反应等问题的发生。
常见免疫学检测方法
常见免疫学检测方法免疫学检测是一种重要的临床检测方法，通过检测免疫系统的功能来评估机体的健康状况。
在临床中，常见的免疫学检测方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和免疫电泳等。
本文将对这些常见的免疫学检测方法进行详细介绍。
一、免疫荧光法免疫荧光法是一种通过荧光显微镜观察样本中荧光染色物的方法，用于检测抗原和抗体的相互作用。
这种方法可以用于检测多种疾病的诊断和病原体的鉴定。
通过标记荧光染料的抗体与待检测物相结合，然后在荧光显微镜下观察荧光信号的强度和位置，以确定样本中是否存在目标物质。
免疫荧光法具有高灵敏度和特异性，广泛应用于临床诊断。
二、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于疾病的早期诊断和治疗监测。
ELISA通过将待测物与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合抗体检测目标物质的含量。
ELISA 方法具有高灵敏度、高特异性和较宽的线性范围，可以同时检测多个样本，适用于大规模筛查和临床诊断。
三、流式细胞术流式细胞术是一种通过激光扫描和细胞荧光标记来分析和鉴定细胞的方法。
该方法可以检测细胞表面标记物、细胞内蛋白的表达以及细胞的功能状态。
流式细胞术通过将细胞悬浮液通过流式细胞仪，利用激光激发细胞中的荧光染料，然后通过多个光学参数来分析细胞的特征。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和多参数分析的优势，被广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
四、免疫电泳免疫电泳是一种通过电场将免疫反应产物分离的方法，用于检测血清或其他生物液中的蛋白质成分。
免疫电泳将待检测样本与抗体结合后，通过电泳分离，然后在电泳胶上观察免疫反应产物的带型。
免疫电泳具有高分辨率和灵敏度，可以检测多种蛋白质异常，如免疫球蛋白、肿瘤标志物等，对于一些免疫相关疾病的诊断具有重要意义。
五、其他免疫学检测方法除了上述常见的免疫学检测方法，还有一些其他方法也被广泛应用于临床检测。
免疫荧光方法
免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。
利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。
免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。
这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。
最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。
基本实验步骤:(1) 细胞准备。
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免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原
【实验目的】
了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用。
【实验用品】
一、材料和标本人体结肠癌培养细胞、HeLa 细胞、小鼠抗人结肠癌细胞抗体(第一抗体)、荧光标记羊抗鼠抗体（第二抗体）。
二、器材和仪器盖片、载片、培养瓶、培养皿、滤纸、镊子、吸管、普通倒置显微
镜，荧光显微镜、微量加样器。
三、试剂 1640 培养液(加 lO％小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液
体石蜡。
【实验内容】
一、原理和意义
用人结肠癌细胞为免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原(Ag)的单克隆
抗体 IgG(第一抗体)，二者可以发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入市售(也可自制)的荧光标记的羊抗鼠 IgG 抗体(第二抗体)，可以与复合物进一步发生抗原抗体反应(二次抗体反应)，这样就可以在荧光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表面的存在(图 19—1)。
图 19 一 l 特异性一次、二次抗原抗体反应过程
二、方法
1．将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中，培养 2～3 天。
2．在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后，在盖片左上角用玻璃笔做一下标记，以免在以后的操作中正反面颠倒。
3．将盖片放在甲醛固定液中，4℃固定 5~10 分钟。
4．用 PBS 洗三次，注意不要将 PBS 液直接倒在盖片的细胞面，以免引起细胞大量丢失。
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用滤纸片将盖片上的 PBS 轻轻吸干，不要损伤细胞层。
5．将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上．每个盖片 50μl，37℃温育 30 分钟。
6．用 PBS 洗三次，滤纸吸干。
7．将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体 5μl 滴加在盖片上，37℃温育 30 分钟。
8．用 PBS 洗三次，滤纸吸干。
9．将载片上滴一滴液体石蜡。
然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上，在荧光显微镜下
观察。
三、结果
细胞多成团块状存在，细胞膜表面显示黄绿色荧光，细胞内及背景均不发光。
每组应
设立一个阴性对照组，以培养的 HeLa 细胞为抗原，操作步骤相同。