溶菌酶
溶菌酶
前景与展望： 溶菌酶是一种小分子碱性蛋白,长期以来一直被作 为一种"模型"体系,用于研究蛋白质的空间构象、 酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。 溶菌酶具有分解细菌细胞壁中的肽聚糖的特殊作 用,因而起着防腐和杀菌作用,同时溶菌酶是高盐 基蛋白质,具有一定保健作用,而且与植酸、聚合 磷酸盐、甘氨酸等结合使用,可大大提高其防腐效 果
简介:
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质（muramidase） 或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病 菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1,4糖 苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽， 导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌 酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、 RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此， 该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
制备原理:
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为 2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前， 溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具 有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作 用。 溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中 性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用 等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。 采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。
步骤： 蛋清溶菌酶分离提取步骤
溶菌酶活力测定
变性与等 电点选择 性沉淀
丙烯酸处 理
乙二醇浓缩
Sephade x G-50 柱层析
蛋清溶菌酶分离提取步骤
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。 用微量进样器取酶液样品10μ L，加入0.5mL 的 0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃ 预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。 37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。 反应液经3000r/min 离心10min，取清液在721型 分光光度计上进行比色(540nm)。空白管用磷酸缓 冲液替代样液。
溶菌酶
溶菌酶溶菌酶溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。
（一）溶菌酶的结构及物理化学性质溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。
相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。
在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。
禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。
溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。
N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。
第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。
分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。
表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性特性数值相对分子质量14 400亚基数 1氨基酸129等电点10.7二硫键数 4碳水化合物所占比例0E1%280nm 26.493℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解（二）溶菌酶的来源溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。
溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。
禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。
表17 -2溶菌酶的来源溶菌酶的来源溶菌酶的含量鸡蛋清 2 500 ~ 3 500μg/mL鸭蛋清 1 000 ~ 1 300μg/mL鹅蛋清500 ~ 700μg/mL眼泪 3 000 ~5 000μg/mL人乳55~ 75 μg/mL牛奶10~ 15μg/mL脾脏50 ~ 160μg/kg胸腺60~ 80μg/kg胰腺20~ 35μg/kg花椰菜汁25~ 28μg/mL木瓜汁8~ 9μg/mL卷心菜汁7~8μg/mL（三）溶菌酶的溶菌机制溶菌酶是一种糖苷水解酶，专门作用于微生物细胞壁，可以破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4-糖苷键，其作用机理见图17 -1。
溶菌酶知识
溶菌酶的研究前景
溶菌酶的作用机制研究
深入探究溶菌酶的作用机制，有助于发现新的溶菌酶种类和功能，为应用研究提供更多可能性。
溶菌酶的基因工程研究
基因工程技术的发展为溶菌酶的研究提供了新的手段，通过基因工程方法改良溶菌酶的性能，提高其稳定性和活性。
溶菌酶的抗菌作用研究
溶菌酶的抗菌作用研究可以为开发新型抗菌药物提供理论基础，有助于解决当前抗生素滥用和耐药性问题。
溶菌酶可以裂解细菌细胞壁，杀死多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，包括金黄 色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌等。
溶菌酶的抗菌作用主要通过裂解肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间 的β-1,4糖苷键，破坏细菌细胞壁，导致细菌溶解死亡。
溶菌酶的抗肿瘤作用
溶菌酶能够激活机体免疫系统，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿 瘤细胞的生长和扩散。
溶菌酶知识
xx年xx月xx日
目录
• 溶菌酶简介 • 溶菌酶的生物活性 • 溶菌酶的生产和应用 • 溶菌酶的研究进展 • 溶菌酶的前景展望
01
溶菌酶简介
溶菌酶的定义
溶菌酶是一种能够裂解细菌细胞壁的肽酶。
它具有广谱的抗菌活性，能够破坏细菌细胞 壁，导致细菌溶解死亡。
溶菌酶的发现
溶菌酶最早是在19世纪末由法国微生物学家Jules Bordet发 现。
05
溶菌酶的前景展望
溶菌酶的应用前景
生物医药领域
在生物医药领域，溶菌酶作为 天然的抗菌剂，具有良好的生 物相容性和安全性，可用于药 物开发、医疗器械灭菌等方面
。
食品安全领域
在食品安全领域，溶菌酶可以用 于食品保鲜和防腐，提高食品卫 生质量，保障食品安全。
环保领域
在环保领域，溶菌酶可以用于水处 理、污染治理等方面，提高环保治 理效果。
溶菌酶
内容1：溶菌酶简介1.1 溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。
溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。
溶菌酶存在在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。
从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。
溶菌酶生理作用在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。
它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用2：溶菌酶的种类溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。
两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。
1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。
1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。
根据来源不同，将溶菌酶分为三类（1）动物源溶菌酶⏹动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。
⏹鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。
鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。
研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。
溶菌酶的名词解释
溶菌酶的名词解释溶菌酶是一种存在于细菌、动物和植物等生物体内的酶类物质，具有分解细菌细胞壁的能力。
这种酶广泛存在于自然界中，对于维持生态平衡和机体免疫防御方面都起着重要作用。
在这篇文章中，我们将详细探讨溶菌酶的特性、功能和应用。
一、溶菌酶的特性溶菌酶是一种水解酶，主要通过水解β-1,4-糖苷键的酶解作用，切断细菌细胞壁的纤维素和肽聚糖链。
溶菌酶可以依据其作用对象分为两类：1）内源性溶菌酶：存在于许多生物体内，如人体分泌的唾液、眼泪、鼻涕中，以及动物和植物体内的细胞和体液中；2）外源性溶菌酶：来自于环境中，如一些细菌和真菌分泌的溶菌酶。
溶菌酶的分子量通常在10,000至20,000道尔顿之间，具有抗菌谱较广的特点。
它是一种相对稳定、热稳定性较好且在酸性条件下活性仍保持较高的酶类物质。
二、溶菌酶的功能溶菌酶在生物体内扮演着重要的角色，具有多种功能。
1）免疫防御：溶菌酶在机体免疫系统中起到重要的作用。
当细菌感染机体时，免疫细胞会释放溶菌酶来破坏细菌的细胞壁，从而抑制其生长和扩散。
这对于维持机体的免疫稳态具有至关重要的意义。
2）消化道健康：人体消化道中存在着多种细菌，其中一些是有益的菌群。
溶菌酶可以促进这些有益菌的生长和繁殖，维护消化道健康。
同时，它还能降低有害菌在消化道内的数量，减少感染和疾病的风险。
3）食品工业应用：由于溶菌酶对细菌具有特异性的杀菌作用，它在食品工业中具有广泛的应用前景。
比如，将溶菌酶应用于食品加工中，可以延长食品的保质期，改善产品的质量和卫生安全性。
三、溶菌酶的应用溶菌酶的研究和应用领域非常广泛，涉及生物医药、食品工业、环境科学等多个领域。
1）生物医药领域：溶菌酶已被广泛应用于临床医学中，特别是在抗生素研发和治疗上。
由于细菌在抗生素中产生耐药性的情况日益严重，溶菌酶作为一种具有独特杀菌作用的物质，被认为是改善抗生素疗效的有力补充。
此外，溶菌酶还可用于细菌感染的快速诊断和疗效评估。
2）食品工业领域：溶菌酶在食品加工过程中的应用正在得到重视。
高考溶菌酶常考知识点
高考溶菌酶常考知识点溶菌酶是一种可以破坏细菌细胞壁的酶类物质。
在高考生物考试中，溶菌酶是一个常见的知识点。
本文将介绍溶菌酶的基本概念、作用机理、应用领域以及相关实验方法。
一、溶菌酶的基本概念溶菌酶也被称为葡萄球菌溶菌酶，是一种能够裂解葡萄球菌细胞壁的酶类物质。
它主要存在于人类和动物体内的各种组织和分泌物中，是一种天然的防御机制。
溶菌酶是由细菌、真菌、植物和动物等生物体产生的一类酶，具有广泛的生物学活性。
二、溶菌酶的作用机理溶菌酶的作用机理主要是通过破坏细菌细胞壁而导致细菌死亡。
它能够降低细菌细胞壁的完整性，导致内部渗漏和细胞内容物外泄，最终导致细胞溶解。
在免疫防御中，溶菌酶可以识别病原菌细胞壁上的特定抗原，从而发挥抗菌作用。
三、溶菌酶的应用领域溶菌酶在医药领域具有广泛的应用价值。
首先，它可以作为一种抗菌剂用于治疗细菌感染性疾病。
其次，溶菌酶还可以作为一种重要的实验工具，用于细菌分子生物学研究中，如基因工程、DNA重组等领域。
此外，溶菌酶还广泛应用于食品工业、饲料工业、环境保护等领域。
四、溶菌酶相关的实验方法在研究溶菌酶时，有几种常用的实验方法可以用来检测其活性和测定其浓度。
首先是溶菌酶活性的检测，常用的方法有酶活性测定法和酒石酸盐凝胶电泳法。
其次是溶菌酶浓度的测定，常用的方法有比色法、生物学活性测定法和免疫学测定法。
五、总结通过对溶菌酶的基本概念、作用机理、应用领域和相关实验方法的介绍，可以看出溶菌酶在生物学领域中具有重要的研究和应用价值。
对于高考生物考试来说，了解溶菌酶的相关知识点，有助于理解细菌的抵抗机制以及抗菌药物的开发和应用。
同时，掌握溶菌酶相关实验方法，可以对细菌研究提供有力的实验手段。
本文对高考溶菌酶的常考知识点进行了概括性的介绍，希望对广大考生有所帮助。
在备考过程中，建议考生加强对溶菌酶相关知识的学习和理解，注重实验方法的掌握，提高解题能力和实验操作水平。
祝愿各位考生取得优异的成绩！。
高中生物：溶菌酶
溶菌酶
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。
溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N■乙酰胞壁酸和N■乙酰氨基葡萄糖之间的p-1,4糖昔键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合体，使病毒失活。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
其中根据其来源的不同，可以将其分为四类，分别是植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。
溶菌酶来自单核细胞、中性粒细胞,是一种能溶解某些细菌的酶类。
可酵解革兰氏阳性球菌壁上的乙酰氨基多糖成分,使细胞壁破裂。
其分子量为14000—15000Da,可从肾小球基底膜滤出,90%以上可被肾小管重吸收，所以尿液中很少或无溶菌酶。
用一种细菌悬液作为基质，加入待测标本后保温一定时间，如标本中含溶菌酶，则细菌被溶解，细菌悬液浊度下降或变清，可用光电比浊法测其浊度变化, 或用平皿法测定其溶菌圈的大小。
溶菌酶配制
溶菌酶配制
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，是一种具杀菌作用的天然抗感染物质，具有抗菌、抗病毒、抗炎、增强抗生素疗效及加快组织恢复的作用。
那么你知道溶菌酶如何配制吗？下面介绍一下溶菌酶配置。
【材料】
1•无菌 PBS ( pH6.4 ， 1/15mol/L )， 10×100 试管，试管架，无菌平皿，打孔器，微量加样器，分光光度计，水浴箱，温箱等。
【方法】
1. 菌液配制：将 PBS 加入枯草芽胞杆菌斜面，置室温5-10 分钟后制成菌悬液；在波长 640nm 处，测定菌悬液的浓度，并将菌液浓度调至透光率 30-40% 。
2. 溶菌酶配制：称取溶菌酶标准品，用 PBS 配成 1000 m g/ml ，置冰箱冻存，等使用时再稀释成 100m g/ml 、 50 m g/ml、 25 m g/ml和 10 m g/ml等详细规格。
以上就是溶菌酶的配置，注意一定要在无菌的情况下配置，否则会失败。
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用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶 菌酶水解的相对速率，结果发现，少于4 个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体 增加到五聚体时，水解速率猛增500倍， 五聚体增加到六聚体，速率增加近8倍， 六聚体增加到八聚体，速率不再变化。这 种情况与X射线晶体结构分析结果一致， 活性部位所在的裂缝(cleft)正好被6个糖残 基所装满。
四·溶菌酶的制备.分离. 活力测试 · . .
溶菌酶（ 实验原理：溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在 ） 1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称 年发现的，它是一种有效的抗菌剂， 年发现的 溶菌酶， 粘肽N-乙酰基胞壁 为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽 乙酰基胞壁 ， 溶菌酶 又称作粘肽 酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52 酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸 和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶 糖苷水解酶， 和谷氨酸 ，是一种糖苷水解酶，能催化水解 粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖 乙酰氨基葡萄糖（ 粘多糖的 乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰 ） 乙酰 胞壁酸（ 糖苷键， 胞壁酸（NAM）间的 ，4糖苷键，相对分子 ）间的β-1， 糖苷键 质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其 氨基酸残基构成， 质量 ， 氨基酸残基构成 中含有较多碱性氨基酸残基， 中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高 左右， 达10.8左右，最适温度为 左右 最适温度为50OC，最适 为6～7 ，最适PH为 ～ 左右。 的消光系数[ 左右。在280nm的消光系数 ]为13.0。该酶活 的消光系数 为 。 性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10性可被一些金属离子 、 、 （ 5～10-3M）以及 乙酰葡萄糖胺所抑制，能被 乙酰葡萄糖胺所抑制， ～ ）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制 Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、 ）、NaCl所激活。 所激活。 、 （ ～ ）、 所激活
三.溶菌酶分布
1.1 鸡蛋清溶菌酶：鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 3.4％～3.5％， 作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点研究的对象，也是了解最清 楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成， 具有4个S-S 键，其分子量为14 000，最适pH为6～7。在pH4～7、100℃处理1 分钟不失活.鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其 水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺 (NAG)的4位碳原子间的β-1，4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主 要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成， NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基 连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几 个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽 聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学 键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于G+细菌与G-细菌，其 细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成， 而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对G+细菌的作用优 于对G-细菌的作用。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 ⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗 去杂物，滤出，用1mol/L NAOH 搅拌浸泡并搅 拌4～8小时，抽滤干, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂， 直到全部转变成氢型，抽滤干HCL, 用蒸馏水 洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0， 抽滤干HCL,用2mol/L NAOH 处理树脂使之转变 为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
在1965年,David Phillips 和他在牛津的同事以 0.2nm分辨率的X射线 晶体结构分析法阐明 了溶菌酶的三维结构.
溶菌酶相对分子质量为14.6X103，由 129个氨基酸组成的单肽链蛋白质， 含有4对二硫键。 溶菌酶分子近椭圆形，大小为 4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较 复杂，α螺旋仅占25%，在分子的一些 区域有伸展着的β片层构象。
⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的 过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱 情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的 pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收 集洗脱液。 ⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内， 置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中 的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩 到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇， 小心取出浓缩液。 (6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。
【实验操作】 1.蛋清的制备 将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清 流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟， 使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带 块，量体积约为100ml。
2.鸡蛋清粗分离 按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去 离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH 值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
溶菌酶的内部几乎全部是非极性的。疏 水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起 重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一 个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多 糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性 部位。
溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水 解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷 键，但不能水解NAG C1和NAM C4之 间的β（1-4）糖苷键。几丁质是甲 壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由 NAG残基通过β（1-4）糖苷键连接 而成，几丁质也是溶菌酶的底物。
溶菌酶
• 组员.刘英炜，甘文圣 ，牛根坡，石方.
一·溶菌酶定义：溶菌酶（lysozyme） 又称 胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚 糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏 多糖的碱性酶。
二·溶菌酶是如何被发现的？
1922年的一天，正 在感冒的英国细菌 学家Alexander Fleming发现，把一 些鼻粘液加入细菌 的培养基后会引起 细胞的溶解。而这 种存在于鼻粘液中 的能杀死细菌的重 要物质被认为是一 种酶， Fleming命名 其为溶菌酶 （ Lysozyme ）。
2实验试剂 ⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋） ⑵ 底物微球菌粉 ⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂 ⑷ 固体氯 化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸 氢二钠（Na2HPO4•12H2O）；固体磷酸二氢钠 （NaH2PO4•2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4） ⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸； 丙酮 (6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌； 氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸 ⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；蛋白含量测定 （福林法）试剂 ⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质
1.3 植物溶菌酶：目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分 离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。植物溶菌酶对 溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳 质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 1.4 微生物产生的溶菌酶：人们从60年代开始，发现微生物也能产 生溶菌酶，并且进展很快。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下 5种：（1）内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌 细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键。（2）酰胺酶，切断细菌细胞壁 肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3） 内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）β-1，3、β-1， 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多 糖酶，这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。
⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析 柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液， 关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的 溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～ 20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液 pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出 树脂表面1cm左右。 ⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到 树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流 速为1ml/min。
四.溶菌酶的作用机理 溶菌酶的作用机理
溶菌酶种类及作用机制溶菌酶按其所作用的微生物不同 分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。 细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于β-1，4糖苷键 的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分 的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁 溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛地分布于自然 界中，在人的组织及分泌物中均可以找到，动物组织中 也有，以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细 胞中也存在。根据来源不同，其性质及作用机制略有差 异。
1.2 人及哺乳动物溶 菌酶：人溶菌酶存在于眼泪、唾液、 鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺和白血球中， 1ml眼泪 中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由 130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600， 其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。对于哺乳动物溶菌酶， 目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化 学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也 远低于人溶菌酶约3000倍。人及哺乳动物溶菌酶的作用 机制与鸡蛋清溶菌酶相同。
4.Sephadex G50分子筛柱层析 ⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤 除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分 钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果 Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝 胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌， 超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm）， 柱床45cm。 ⑵ 上样：与实验五中的方法相同。 ⑶ 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗 脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为 0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。