人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达
人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达
人溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活性物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。但由于制备材料来源有限,产物分离纯化费用高等因素,hLYZ的应用受到了极大的限制。本论文旨在利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的hLYZ,以期降低生产成本解决溶菌酶应用受限的问题。
主要研究内容如下:(1)将α信号肽和hLYZ基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重组子K1。K1摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为260
mg·L-1,总酶活为12,937 U·mL-1。
在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW·L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g·L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g·L-1,总酶活达到262,152 U·mL-1。(2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和hLYZ基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg·L-1,总酶活为16,974 U·mL-1,均优于K1。
在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g·L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U·mL-1,比 K1 略低。(3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW·L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g·L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g·L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g·L-1。
采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g·L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g·L-1,未出现明显的蛋白降解现象。上述二种诱导策略下最高的总酶活水平分别为324,072 U·mL-1 和 290,438
U·mL-1。(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ属于同尾酶的特点,设计多拷贝串联hLYZ基因表达载体,并获得了两拷贝及四拷贝串联hLYZ基因转化重组子K-2-2、K-4-2。
摇瓶发酵条件下,K-2-2和K-4-2的最高总蛋白浓度分别为193.0mg·L-1和185.3 mg·L-1,对应的总酶活分别为5,256 U·mL-1和5,424 U·mL-1。5 L发酵罐中,K-2-2低细胞密度(～50 g-DCW·L-1)诱导73 h及高细胞密度(～100
g-DCW·L-1)诱导65 h后,发酵液中的总蛋白浓度分别为0.79 g·L-1和0.93 g·L-1,总酶活分别为70,332 U·mL-1和71,529 U·mL-1,约为重组子K1的50%。K-4-2诱导表达10 h后细胞失去活性,发酵失败。
多拷贝串联hLYZ基因转化重组子的溶菌酶表达性能较低。
人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达
圈 ２０１０，ＶｏＩ．２７ Ｎｏ．２亿 与生物互程 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
人乙醛脱氢酶２基因在毕赤酵母中的高效表达
赵锦，赵玉凤，黄锟。雷明科，吴元欣。刘洋
（武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北武汉４３００７３）
摘 要：去除自行构建的质粒ｐＰＩＣ９Ｋ－０７ＡＬＤＨ２的信号￣（ｔｒＦａｃｔｏｒ）得到质粒ｐＰＩＣ９Ｋ－ＡＬＤＨ２一ｄｅｌｓｉｇｎ，采用电转化方 法将该质粒转化到Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤｌ１６８中构建得到能在胞内高效表达人乙醛脱氢酶２（ＡＬＤＨ２）的基因工程菌株 Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤｌ１６８（ｐＰＩＣ９Ｋ－ＡＬＤＨ２一ｄｅｌｓｉｇｎ）。利用该重组毕赤酵母摇瓶发酵得到的发酵液的人ＡＬＤＨ２的酶活为 ０．３１５ Ｕ・ｍＬ＿。，明显高于胞外表达时人ＡＬＤＨ２的酶活；经过亲和色谱分离纯化后的人ＡＬＤＨ２酶液的酶活为０．９４４ Ｕ・ ｍＬ。 关键词：毕赤酵母；乙醛脱氢酶；高效表达 中图分类号：Ｑ ７８ Ｑ ５１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—５４２５（２０１０）０２一Ｏ０５Ｏ—Ｏ３
目前在人体中已发现的乙醛脱氢酶（Ａｃｅｔａｌｄｅ—
ｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡＬＤＨ）有１９种，主要分布在肝、
胃、心脏等器官中，最常见的有ＡＬＤＨ１～ＡＬＤＨ４四
种。其中ＡＬＤＨ２处在线粒体内，表现出基因多态
性 ，是人体酒精代谢的关键酶 引，在肝脏和胃中有
很高的表达量【４］。关于乙醛脱氢酶的研究很多，已报
道了该酶的诱导剂、激活剂、抑制剂，并对该酶分离提
纯，还通过基因工程在大肠杆菌和植物体内对该酶基
因进行表达 ］，但目前采用基因工程的方法利用微
生物发酵生产ＡＬＤＨ２的报道仍较少。利用重组毕赤
酵母分泌表达人乙醛脱氢酶２（ＡＩ ＤＨ２）时，由于在表
达过程中失活严重，很难得到大量有活性的人ＡＬ—
ＤＨ２。
作者在此研究了人ＡＩ ＤＨ２在毕赤酵母中的高效
毕赤酵母表达知识
毕赤酵母表达知识
很好，需要好好研究一下
原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非
a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：
1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）
1、制感受态细胞，OD多少比较好？
pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10)
分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低
2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only
lithium chloride.
3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？
我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！
5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。都是从园里看到的！
电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400） 6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结
甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较
1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+
2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++
3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++=
4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+
5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++
+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多
EasySelect Pichia Expression System
产品性能：
优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化
缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会：
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。
重组表达载体ppic9k-hepcidin的构建及其在毕赤酵母中的表达和鉴定
北京化工大学
硕士学位论文
重组表达载体pPIC9K-Hepcidin的构建及其在毕赤酵母中的表达
和鉴定
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：环境工程
指导教师：***
20050615北京化工大学硕士毕业论文
重组表达载体ｐＰＩｃ９Ｋ＿Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的构建
及其在毕赤酵母中的表达和鉴定
摘要
Ｈ印ｃｉｄｉｎ是一个富含半胱氨酸的抗菌多肽。研究显示，Ｈ印ｃｉｄｉｎ极有可能
一种能够控制小肠铁吸收以及调解体内铁稳态的关键物质，是一种极为重要的铁调节激素。
本文采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增已合成并克隆入ｐＭＤｌ８．Ｔ载体中的
２５个ＡＡ残基的Ｈ印ｃｉｄ血，酶切后将其插入含ＡＯｘｌ启动子和伐分泌信号肽序
列的Ｐｆｃ＾妇ｐ甜幻ｒ括酵母表达载体ｐＰＩｃ９Ｋ中，构建重组表达质粒
ｐＰＩｃ９Ｋ—Ｈ印ｃｉｄｉｎ，转化克隆宿主菌ＤＨ５Ⅱ，经Ｄ咐Ａ序列分析后，取阳性转化予
转化酵母宿主菌｝：Ｍ７ｌ，筛选多拷贝整合转化子，摇瓶培养，０．５％甲醇诱导表达。
Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳检测目的蛋白的表达水平，又通过重组蛋白的体外抑菌
活性实验检测目的蛋白的生物活性。
结果显示，所设计合成的基因片段正确插入了ｐＰＩＣ９Ｋ，成功的构建了重组
表达载体ｐＰＩｃ９Ｋ－Ｈ印ｃｉｄｉｎ，ＤＮＡ序列分析说明目的基因插入的正确性。
Ｔｒｉｃｉｎｅ—ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析显示，诱导４ｄ的培养上清中Ｈｅｐｃｉｍｎ表达量达到最高。
不同拷贝数的菌株的诱导表达实验对比发现，重组蛋白最高可占到上清总蛋白的８７．１％，其表达量最高可达１８７．３ｍ啦。
由此得出的结论是：可在Ｐｉｅ自洒明ｓ研括酵母表达系统中实现Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的有
效表达。
关键词Ｈｅｐｃｉｄｉｎ，毕赤酵母，同源重组，
分泌表达北京化工大学硕士毕业论文
ＣｏＮＳＴＲＵＣＴＩｏＮｏＦＲＥＣｏＭＢＩＮＡＮＴＰＬＡＳＭＩＤ
ｐＰＩＣ９Ｋ—ＨｅｐｃｉｄｉｎＡＮＤＳＥＣＲＥＴＥＸＰＲＥＳＳＩｏＮＡＮＤ
ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩｏＮｏＦＨＵＭＡＮＨＥＰＣＩＤｌＮ
人胰岛素原在毕赤酵母中的高效分泌表达
人胰岛素原在毕赤酵母中的高效分泌表达
摘要：【目的】设计含有新型前导肽的人胰岛素原分子，构建高效表达人胰岛素原的基因工程菌。【方法】通过化学合成人胰岛素原的编码基因，用限制性内切酶XhoI和NotI插入到诱导型分泌表达载体pPICZαA的α-factor信号肽序列的下游，构建重组表达载体，线性化处理后电击转化到毕赤酵母X-33感受态细胞，经Zeocin抗性筛选和摇瓶筛选得到人胰岛素原基因工程菌株X-33/pPICZαA-INS。用20L发酵罐对该工程菌进行高密度发酵，表达人胰岛素原。【结论】20L罐高密度发酵时人胰岛素原产量达到5.9g/L，实现了高效分泌表达，为重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素等药物的开发奠定了基矗
关键词：根据国际糖尿病联盟的统计，2017年全球糖尿病患者人数达到4.25亿，其中中国糖尿病患者人数达到1.144亿，是全世界糖尿病患者最多的国家[1]。重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素作为最重要的降血糖药物，在治疗各种胰岛素缺乏的糖尿病患者中具有很好的疗效，有着巨大的市场需求。
人胰岛素原是生产重组人胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素以及他新型胰岛素类似物的前体蛋白，具有重要的工业应用价值。人胰岛素原已经在不同的系统中得到了表达，如大肠杆菌、酵母等[2-5]。在大肠杆菌表达系统中，人胰岛素原通常以包涵体的形式表达，发酵后需要变性和复性，工艺复杂、生产成本高。酵母拥有完善的蛋白加工、修饰机制，可以使人胰岛素原进行正确的折叠，形成带有正确的二硫化桥的产物，实现可溶性表达，后续制备工艺简单。
毕赤酵母（Pichia Pastoris）是一种非常优秀的外源蛋白表达系统，它不仅具有其他高等真核表达系统的优势，如蛋白加工、蛋白折叠、翻译后修饰等，还具有大肠杆菌等原核表达系统的优势，如生长迅速、培养简单、培养基价格低廉等。此外毕赤酵母还具有功能强大的、甲醇调节的AOX1启动子，表达稳定，分泌能力强，易于高密度细胞生长等优点。目前，已有许多外源蛋白质在毕赤酵母表达系统中实现了从mg/L到g/L的表达水平[6]。
巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶
巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶
陈晶晶;陈劲春
【期刊名称】《北京化工大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2006(033)006
【摘 要】对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究.结果表明:将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35g/L和5g/L时,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大,但培养时间可减少4h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为4.0对目标蛋白的表达最有利,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的70%,比原来增加了近30%;分离纯化过程,采用将强阳离子(SPFF)与弱阴离子(DEAE)交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,目标蛋白产量约为50mg/L;将目标蛋白酶切后,质量酶活性为8.56×10-3mol/(sg).
【总页数】4页(P34-37)
【作 者】陈晶晶;陈劲春
【作者单位】北京化工大学,生命科学与技术学院,北京,100029;北京化工大学,生命科学与技术学院,北京,100029
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ92
【相关文献】 1.巴斯德毕赤酵母表达重组人对氧磷酶1的r发酵条件优化 [J], 廖一波;于子桐;潘力;叶燕锐
2.重组巴斯德毕赤酵母发酵生产几丁质酶的条件优化研究 [J], 阎瑞香;吴仲;侯建华;李明钢
3.重组巴斯德毕赤酵母Muts型与Mut+型菌株产真菌α-淀粉酶发酵性能的比较
[J], 张齐;李松;沈微;王正祥
4.重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究 [J], 李松;王正祥
5.重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶 [J], 李洪淼;王红宁;许钦坤
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密码子优化人PD-L1基因在巴斯德毕赤酵母中的表达与鉴定
密码子优化人PD-L1基因在巴斯德毕赤酵母中的表达与鉴定
战映璇;王环;汤潜;玄超;于建立;张霞;王清
【期刊名称】《精准医学杂志》
【年(卷),期】2022(37)4
【摘 要】目的利用巴斯德毕赤酵母获得具有可溶性、免疫原性的重组PD-L1蛋白。方法根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子使用偏好,优化人PD-L1基因序列,将优化后的序列构建至质粒pPIC9K,合成重组质粒pPIC9K-PDL1。使用SacⅠ-HF将pPIC9K-PDL1线性化,然后通过电击法将pPIC9K-PDL1上的PD-L1基因序列整合至巴斯德毕赤酵母基因组中,依次使用MD平板(无组氨酸)和遗传霉素G418从电击处理过的菌液中筛选重组巴斯德毕赤酵母菌株,然后使用PCR和测序对筛选到的菌株进行鉴定。利用甲醇体积分数为0.005的BMMY培养基诱导重组巴斯德毕赤酵母菌株表达,使用免疫印迹法检测菌株培养基上清液中的表达产物。结果筛选得到了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,表达的PD-L1相对分子质量约为44700,可以与抗PD-L1抗体特异性结合。结论成功构建了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,菌株表达的PD-L1蛋白可用于开发血清PD-L1检测试剂盒。
【总页数】5页(P342-346)
【作 者】战映璇;王环;汤潜;玄超;于建立;张霞;王清
【作者单位】青岛大学医学部;青岛大学附属医院检验科;中国科学院青岛生物能源与过程研究所;深圳市国创纳米抗体技术有限公司
【正文语种】中 文 【中图分类】R394.3;R392.116
【相关文献】
1.一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达2.人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达3.人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达4.人白血病抑制因子基因在巴斯德毕赤酵母中的表达5.突变型人白细胞介素-2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
表达人源SOD的毕赤酵母重组子的构建
中国医科大学学报第４６卷第１２期２０１７年１２月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．４６ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃ．２０１７
表达人源ＳＯＤ的毕赤酵母重组子的构建
李新呜 ，孙冶 ，肖纯凌。 （１．沈阳医学院基础医学院病原生物学教研室，沈阳１１００３４；２．辽宁省环境污染与微生态重点实验室，沈阳１１００３４） ・论著・
摘要 目的研究在毕赤酵母重组子中高表达有活性人源超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）方法。方法在毕赤酵母构建表达重组人源 ＳＯＤ，对培养时间、培养基中铜离子浓度和甲醇诱导条件进行优化，并初步纯４ＥＳＯＤ。结果获得了５个稳定表达人源ＳＯＤ的毕赤 酵母重组子。色谱层析方法分离纯化重组子培养上清中的ＳＯＤ。在培养４８ ｈ，培养基中铜离子浓度０．５％、甲醇诱导浓度１％时上清 中ＳＯＤ分泌量多，同时活力最好。结论建立毕赤酵母表达可溶性人源ＳＯＤ的有效方法，实现了在毕赤酵母系统高效表达有活性 人源ＳＯＤ。为发酵生产人源ＳＯＤ提供了研究基础。 关键词 毕赤酵母；重组子；人源超氧化物歧化酶 中图分类号Ｑ９３—３３５ 文献标志码Ｂ 文章编号０２５８—４６４６（２０１７）１２—１ １ １７—０７ 网络出版地址ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２１．１２２７．Ｒ．２０１７１１３０．１８１０．０２４．ｈｔｍｌ ＤｏＩ：１０．１２００７￣．ｉｓｓｎ．０２５８—４６４６．２０１７．１２．０１３
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐ／ｃｈ／ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＯＤ
ＬＩ Ｘｉｎｍｉｎｇｌ，２，ＳＵＮ ｙｅ１，２＇ＸＩＡＯ Ｃｈｕｎｌｉｎｇ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈｅｎｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００３４，Ｃｈｉｎａ；２．ＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００３４，Ｃｈｉｎａ）
在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究
第２６卷第３期 ２００８年６月 上海交通大学学报（农业科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ） Ｖ０１．２６ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２００８
文章编号：１６７１—９９６４（２００８）０３—０２３３．０４
在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究
胡 乔 ，赵凌侠 ，唐克轩
（１．上海交通大学农业与生物学院，上海２００２４０；２．上海交通大学生命科学技术学院，上海２００２４０）
摘要：将化学合成的人溶菌酶基因ｈＬＹＺ（４４４ ｂｐ）构建到毕赤酵母分泌型表达载体ｐＰＩＣＺ上；载体质粒用Ｓａｃ Ｉ线性化后电击
法转化毕赤酵母菌株ＧＳｌｌ５，在含Ｚｅｏｃｉｎ的抗性培养基筛选后ＰＣＲ鉴定获得了９株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达
上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果显示，重组ｈＬＹＺ在毕赤酵母中成功表达，在诱导６０ ｈ时表达量最高。用
镍亲和层析柱纯化重组ｈＬＹｚ。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测得其含量约为３２４ ｍｇ・Ｌ～。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活
性达到４４７３ Ｕ．ｍ『『 本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶，井探索了简单有效的纯化和活性测定方
法．为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。
关键词：人溶菌酶；毕赤酵母；生物活性 中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ
Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＨＵ Ｑ ∞ ２，ＺＨＡ ０ Ｌｉｎｇ－ｘｉｄ，ＴＡＮＧ Ｋｅ－ｘｕａｎ
（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈｍ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
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由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。所以，载体必须整合入酵母基因组中才能实现异源蛋白的稳定表达。