人工合成人溶菌酶基因在大肠杆菌中表达
2020年高考山东版高考生物 专题24 基因工程
专题24 基因工程挖命题【考情探究】考点考向考题示例素养要素难度预测热度1基因工程的原理及技术基因工程的基本操作程序2018课标全国Ⅰ,38,15分生命观念,科学思维中★★★基因工程的应用2018天津理综,10,14分生命观念,社会责任中★★★2基因工程的应用与蛋白质工程蛋白质工程2015课标全国Ⅱ,40,15分生命观念,科学探究0.4173★☆☆分析解读 基因工程在“生物工程技术”模块中占有举足轻重的地位,是高考命题的高频考点。
常考查基因工程三种工具的特点和作用、基因工程操作各个步骤的原理和方法。
高考命题时常常结合具体实例综合考查基因工程的基本操作程序和操作原理,其中限制酶的选择、基因表达载体的构建、目的基因的检测和鉴定等是本专题的难点,复习时应注意归纳梳理基因工程的基础知识,注重重难点知识的突破训练。
【真题典例】破考点考点一 基因工程的原理及技术【考点集训】考向 基因工程的基本操作程序1.(2019届黑龙江哈尔滨六中第二次月考,54)绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的,为培育能发出绿色荧光的小鼠,人们设计了如下的流程:(1)获取绿色荧光蛋白基因的常用方法有从基因文库中获取和 等。
(2)绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取,含有一种生物一部分基因的文库称为 。
(3)A过程是基因工程的核心,常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和 , 它们作用的化学键是 。
一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还需有 、 以及标记基因等。
(4)B过程常用的方法是 。
(5)通常采用 技术检测外源基因是否插入到小鼠的基因组。
答案 (1)人工合成 (2)部分基因文库 (3)DNA连接酶 磷酸二酯键 启动子 终止子 (4)显微注射技术 (5)DNA分子杂交2.(2019届江苏徐州一中升级考试,41) PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规手段,其过程如图,PCR与DNA体内复制的比较如表,请回答下列问题:原料ATPDNA体内复制四种脱氧核苷酸需要脱氧胞苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸PCR不需要脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸(1)加热使DNA双链打开,这一步是打开 键,称为 ,在细胞中是在 酶的作用下进行的。
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究
人溶菌酶是一种能够破坏细菌细胞壁的酶类蛋白，在医学领域被广泛应用于消化系统
疾病和感染性疾病的治疗中。
然而，人溶菌酶的制备技术还存在一些问题，例如制备成本高、生产周期长、难以大规模生产等。
因此，寻找一种高效、便捷的生产方法就显得尤为
重要。
而毕赤酵母优秀的表达系统和相对简单的培养可以为人溶菌酶的生产提供新的思路。
本研究通过构建含有人溶菌酶基因的毕赤酵母表达载体，并通过质粒转化的方式将其
导入毕赤酵母中，以达到在毕赤酵母中表达人溶菌酶的目的。
在完成酵母工程的基础上，
我们对毕赤酵母中表达的人溶菌酶进行了体外抑菌活性的研究。
首先，我们对表达的人溶菌酶进行了酶学鉴定，结果显示表达的蛋白质具有溶菌酶酶
学特性，说明载体成功导入毕赤酵母并表达了人溶菌酶。
接下来，我们研究了不同表达条
件（包括温度、pH值、培养时间）对人溶菌酶表达和活性的影响。
结果表明，在30℃、
pH值为6.5-7.0、培养时间为48小时的条件下，人溶菌酶的表达和活性均能达到最大值。
此外，在表达过程中添加1mmol/L的CaCl2可以提高人溶菌酶的表达量和活性。
最后，我们进行了体外抑菌实验，通过测试人溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
杀菌效果来评价它的体外抑菌活性。
结果显示，在添加人溶菌酶的情况下，大肠杆菌和金
黄色葡萄球菌的菌落数显著降低，说明表达的人溶菌酶具有较强的体外抑菌活性。
基因工程知识点总结
基因工程的诞生Berg构建第一个重组体及Cohen构建第一个有功能重组体两个经典实验的巧妙设计、以及基因工程的基本特点。
基因工程的基本定义对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。
分为上游和下游技术。
上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程）下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。
基因工程又称为：gene manipulation,genecloning,recombinant DNA technoglogy, genetic modification,new genetics,molecular agriculture重组DNA技术、基因工程的基本过程1）材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。
用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。
2）目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。
3）重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。
4）筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。
进一步可将基本步骤概括为：切、接、转、增、检［步骤演示］基因工程的基本原理：主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的：1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。
2）筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。
3）修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：。
PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。
4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。
溶菌酶的修饰及其在动物生产中的应用研究进展
业中的应用潜力进行展望，以期为溶菌酶在畜牧业中的广泛应用提供参考。
关键词：溶菌酶；抗菌；改性；动物应用
中图分类号：S816
文献标识码：A
DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20200730-05
近年来，抗生素滥用问题引起了全社会的关注，抗 生素在畜牧业中的应用也受到了诸多限制。2016 年 7 月 26 日，我国农业部（现为农业农村部，下同）发布 2428 号文件，要求 2017 年 5 月 1 日停止使用硫酸粘杆菌素饲 料添加剂预混剂。2018 年 1 月 11 日，农业农村部发布 第 2638 号公告，要求停止在食品动物中使用喹乙醇、氨 苯胂酸、洛克沙胂等 3 种兽药，以保障动物产品质量安全， 维护公共卫生安全和生态安全。2019 年 7 月 9 日，农业 农村部发布第 194 号公告，要求 2020 年 1 月 1 日起将退 出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。饲料 端全面禁抗、养殖端减抗限抗已成大势所趋。在此背景 下，寻找替代抗生素的新型绿色添加剂成为动物营养领 域的研究热点。溶菌酶（Lysozyme，LZ）是一种有效的 抗菌酶，于 1921 年由苏格兰生物学家亚历山大 • 弗莱明 发现 [1]，此后便涌现出大量关于溶菌酶的基础科学研究。 溶菌酶是动物机体中的非特异性免疫因子，能够直接作 用于革兰氏阳性菌（G+）细胞壁，在渗透压作用下使微
生物细胞胀裂死亡。革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁黏肽 层外有一层脂多糖和脂蛋白，对天然溶菌酶具有抗性， 故天然溶菌酶对 G- 几乎无抑菌作用。近年来国内外学者 不断尝试通过化学、物理、生物改性等方法对溶菌酶进 行修饰，拓宽其抑菌谱，提高杀菌能力。溶菌酶与抗生 素杀菌机制不同，不易产生耐药性，具有安全、无残留、 活性稳定等优良抗菌特性，已逐渐应用于畜禽饲料中。 本文就溶菌酶的修饰技术以及在动物生产中的应用进行 综述，旨在为溶菌酶的开发和利用提供理论参考和依据。
氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究
学号：091201215分子生物学实验论文(2009级本科)题目：氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究系（部）院：农业与生物技术学院专业：生物工程作者姓名：何增寿完成日期：2011年12月10日二零一一年十二月氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究（农业与生物技术学院工程09（2）班何增寿091201202）摘要：为研究人工合成的氨苄青霉素在大肠杆菌中的抗性表达，利用PGEM--Teasy质粒为载体，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出抗氨苄青霉素的基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切电泳图分析。
结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中表达并复制。
关键字：氨苄青霉素抗性大肠杆菌研究引言：在分子生物学日益普及的今天, 基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA 重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达, 从而得到大量的重组基因。
其中尤以转化为主。
目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物: 第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞, 其转化效率十分可靠, 一般可以达到108 的转化子/μg 质粒DNA, 但是相当昂贵, 通常选择的是自制感受态细胞的储存物。
因此, 感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节, 其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM--Teasy质粒 Taq酶1.1.2 仪器：基因扩增仪移液器电泳仪紫外检测仪恒温摇床恒温水浴器恒温培养箱低温离心机超净工作台冰箱离心管小指管1.1.3 试剂： PCR缓冲液(含Mg2＋) 4种dNTP Taq酶 DNA模板两种引物（正向引物和反向引物） EB溶液氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素氯化钙(CaCl2) 酒精灯牙签 LB液体培养基 ddHO 溶液Ⅰ（50 mmol/L 葡2萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合溶液Ⅲ 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。
γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达
（ ＋ ） － ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ， 导入 宿 主 Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒ ｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ中 ， 诱 导使 之 表 达 。 将发 酵 液 离心 去 除 茵 体 ， 得 到 上 清 液 用 旋 转 蒸 发 仪
浓 缩后 。 采用 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳 检 测 重组 菌 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒ ｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ ｌ ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ － ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ 产 生的 ￣ ／ － Ｐ Ｇ Ａ分子量在 ２ ０ ０ － ３ ０ ０ ｋ Ｄ ａ 之 间，
ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ， ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｉ ｔ ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ．Ｄｅ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ｗｉ ｔ ｈ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｒ ｏ ｔ ｈ， ｃ ｅ ｎ ｔ ｉ ｒ ｆ ｕ ｇ ｅ ｄ ｔ ｏ ｒ ｅ ｍｏ ｖ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｂ ｏ ｄ ｙ ａ ｎ ｄ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｓ ｕ ｐ ｅ ｍａ ｔ ａ ｎ ｔ ，ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧＥ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ Ｐ ＧＡ ｍｏ ｌ ａ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｗｅ ｉ ｇ ｈ ｔ ｂ ｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ２ ０ ０ — ３ ０ ０ ｋ Ｄａ ｐ ｒ ｏ －
将产物水解 ， 采 用 薄 层层 析 法 鉴 定 产 物 由 单 一 的谷 氨 酸 组 成 ， 表明 一 Ｐ Ｇ Ａ合成酶基 因ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ 在 大 肠 杆 菌 中成 功 表
达。
关键词 ： 大肠 杆 菌 ； 聚谷氨酸合成酶； 克隆 ； 表 达
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为Ba mHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：模板（含R基因的重组质粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补至100μlPCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pR SETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Ki t或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：pRSETA1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O补至10μl3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
人类抗菌肽及溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的白念珠菌的协同抗菌作用
为另～类重要的天然阳离子抗菌肽，由于其氨基酸序列以两个亮氨酸 （Ｌｅｕｃｉｎｅ，简称Ｌ）起始，共３７个氨基酸残基而得名。ＬＬ一３７在中性粒细 胞组成性分泌，在角质形成细胞可被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗微生 物活性，可杀灭细菌、真菌以及病毒。溶菌酶主要存在于分泌细胞、角 质形成细胞和汗液、唾液、泪液、乳汁等体液中，也具有杀灭细菌和真 菌的能力。已有报告人类ａ防御素和ＬＬ．３７能协同抗金黄色葡萄球菌（金 葡菌）和大肠杆菌，也有报告人类正常皮肤的ｐＨ值为酸性。而ｈ／３Ｄ一１、 ｈＢＤ一２、ｈＢＤ．３、ＬＬ．３７以及溶菌酶能否在中性及酸性ｐＨ条件下协同抗细 菌及真菌尚未见报道。 目的：研究在酸性和中性ｐＨ条件下ｈＢＤ一１、ｈＢＤ一２、ｈＢＤ一３、ＬＬ一３７ 以及溶菌酶对金葡菌、大肠杆菌和白念珠菌的协同抗菌作用。 方法：抗菌肽和溶菌酶的抗金葡菌和大肠杆菌敏感性用微量稀释法 检测，抗白念珠菌活性采用稍加修改的美［雪ＮＣＣＬＳ ＣＮａｔｉｏｎａｌ
ｔｏ
ａｎｄ
ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｉｔ
ａｓ
ｉｓ
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ｉｎ
ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ
ｃｅｌｌｓ，
ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ
ａｎｄ ｂｏｄｙ
ｆｌｕｉｄ ｓｕｃｈ
ｓｗｅａｔ，ｓａｌｉｖａ，ｔｅａｒｓ
ａｎｄ ｈｕｍａｎ
ｍｉｌｋ ｅｔｃ，
ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈｕｍａｎ ｕ—ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ
ｒｅｍａｉｎｅｄ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ．Ｉｎ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ＬＬ一３７
ａｎｄ
ｌｙｓｏｚｙｍｅ
ａｇａｉｎｓｔ
Ｃａｌｂｉｃａｎｓ ｕｎｄｅｒ ａｃｉｄｉｃ
ｐＨ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｗｈｅｎ
密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析
密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析徐艳艳;廖志银;王珍;王首锋【期刊名称】《浙江大学学报:理学版》【年(卷),期】2022(49)6【摘要】人溶菌酶(humanlysozyme,hLYZ)是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。
根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。
通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。
在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^(-1)、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为(2414.9±108.1)U·mL^(-1),蛋白浓度为166.7μg·mL^(-1)。
发酵液上清经过SephadexG50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。
抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。
【总页数】7页(P753-759)【作者】徐艳艳;廖志银;王珍;王首锋【作者单位】浙江大学基础医学系;绿城农科检测技术有限公司;浙江省微生物生化与代谢工程省级重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q87【相关文献】1.人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析2.人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测3.凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测4.一种来源于酒曲地衣芽孢杆菌溶菌酶基因在毕赤酵母中的诱导表达及活性分析5.蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。