植物基因在大肠杆菌中的原核表达
水稻密码子优化的cry1Ca基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备
水 稻螟 虫是 造成 水稻减 产 的常发 性 害虫 ，我 国 每 年 由于水 稻螟 虫 为 害 的 面积 约 ０ １ ． ５亿 ｈ ，其 ｍＺ
ｗａ ｈ ｎ ｐ ｒｆ ｄ ｗｉｈ Ｎｉ ｓｔｅ ｕ ｉｅ ｔ — ｉ ＮＴＡ ｆｅ ｒ ａ ｍｅ ｔｏ ｏ ｖ ｎ ｓ ａ ｔ ｒｔ ｅ ｔ ｎ ｆｓ ｌ ｅ ｔ ．Ｔｈ ａ ｇ ｔｐ ｏ ｅ ｎ ｗａ ｓ ｄ ａ ｈ ｎ ｉ ｅ ｏ ｉ ｅ ｔ ｒ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓｕ ｅ ｓｔ ｅ ａ ｔｇ ｎ ｔ ｍｍｕ ｉｅ ｎｚ ｒ ｂ ｉ ．ＥＬＩ Ａ ｓ ａ ｈ ｗｅ ｔ ａ ｈ ｉｅ ｆ ｔ ｅ ｒ ｐ ｒ ｄ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌ ａ ｔｂ ｄ ｓ ： ５ ０ ａ ｂｔ ｓ Ｓ ａ ｓ ｙ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔ ｔ ｅ ｔｔ ｒ ｏ ｈ ｐ ｅ ａ ｅ ｐ ｌ ｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ ｗａ ｌ ０ ０ ０，ａ ｄ ｈ ｄ ｈ ｇ ｎ ａ ｉｈ
要 ：将 水 稻 偏 好 密 码 子 优 化 并 人 工 合 成 抗 虫 基 因 ｃｙ Ｃ ｒ ｌ ａ通 过 限 制 性 内切 酶 酶 切 的 方 法 构 建 原 核 表 达 载 体
ｐ Ｔ一２ｂ ａ Ｅ ８ ｃ ，成 功 表 达 了带 ６个 组 氨 酸 标 签 的 Ｈｉ ｃｙ Ｃ 融 合 蛋 白 ，其 表 达 量 约 占菌 体 总 蛋 白 的 ２ ，表 达 的 ｓ ｒｌ ａ — ４ 融 合 蛋 白 主要 以包 涵 体 的形 式 存 在 。对 包 涵 体 蛋 白进 行 可溶 性 处 理 ，亲 和 纯 化 出 带 ６个 组 氨 酸 标 签 的融 合 蛋 白 ， 将 其 作 为抗 原 免疫 家兔 获 得 了滴 度 （ ＩＳ Ｅ Ａ） 为 ｌ ５ ０ Ｉ ： Ｏ０ ０的抗 血 清 ，并 具 有 较 强 的 特 异 性 。 关键 词 ：ｃｙ Ｃ ｒ ｌ ａ基 因 ；原 核 表 达 ；融 合 蛋 白 ；多 克 隆 抗 体
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达熊帅;张军科;谌悦【摘要】[目的]从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础.[方法]根据Genbank 中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP 基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序.然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳.对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测.[结果]苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP.X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在.[结论]成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)002【总页数】7页(P123-128,134)【关键词】苹果;多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白;基因克隆;内源多聚半乳糖醛酸酶【作者】熊帅;张军科;谌悦【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S661.1植物细胞壁可以有效地阻碍植物病原真菌的侵染，但植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁。
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
白菜BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达
[收稿日期]20060626 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30370975);浙江省重大科技项目(2005C12019-02) [第一作者简介]张 弢(5),女,黑龙江双鸭山市人,农学博士,主要从事植物分子生物学研究 [通讯作者]曹家树,博士,教授,博士生导师白菜BcM F 2基因在大肠杆菌中的高效表达 张 弢 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;莱阳农学院生命科学学院,山东青岛266109) 刘乐承 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025) 曹家树 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029)[摘要]通过PCR 方法扩增BcMF2cDNA 完整的编码区序列,构建p ET 2BcM F2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IP TG 诱导融合蛋白高效表达;SDS 2PA GE 电泳检测发现在70kD 处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IP TG 终浓度为0.4～1.0mmol L -1时诱导6h ,均能获得较高的表达量。
[关键词]白菜(B r assica c ampestr is L.ssp.Chinensis Ma kino );多聚半乳糖醛酸酶;BcM F2;原核表达[中图分类号]Q786[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)03015303多聚半乳糖醛酸酶(polygalact urona se ,P G )基因参与植物发育的许多阶段,在果实、叶和花脱落以及花粉发育中起着重要作用。
目前,许多植物中的P G 基因得到了克隆,其中包括与花粉发育相关的P G 基因如玉米花粉中PG (X 57627)[1]、油菜花粉中大量表达的P G 基因(L19879)[2]、烟草花粉特异的N p g 1(X71020)[3]、苜蓿花粉中特异表达的P G 基因P 73(U20431)[4]等等。
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植物基因在大肠杆菌中的原核表达
通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。
植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。
不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。
以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。
1.准备工作（试剂配置和器材准备）
1)操作流程示意图
主要步骤操作
①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收
②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化
④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白
⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签
2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。
3)宿主菌的保存。
长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。
4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。
2.操作步骤
[1] 制备载体
1）载体消化和胶纯化
3μg pET载体
3μl 10×限制性内切酶buffer
10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%）
3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要
补足水到30μl
2)37℃温浴2-4h
3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度
4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min
5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。
6)-20℃保存备用。
[2]制备插入片段
限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。
一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。
但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
[3]在pET32a载体中插入片段
连接反应
2μl 10×连接buffer
2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体
1μl T4连接酶
5-7μl 预制目标基因插入片段
加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h－过夜
[4]转化
转化方法同T－载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。
筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。
[5]pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
[6]DE3溶原菌的诱导表达
（1）、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养2-3小时。
（3）、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）、机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
3.总结（注意事项）
(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。
(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油（19%）中会导致质粒不稳定。
(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。
在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。