第二章：分子克隆的工具酶.

第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
① 同序同切 这些酶识别序列和切割位置都相同 HindII HincII GTY/RAC
HpaII
MobI
HapII
Sau3AI
C/CGG
/GATC
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同
KpnI Acc65I
GGTAC/C G/GTACC
Asp718I G/GTACC
AatII
BsaHI
在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIII GG↓CC EcoRV GAT↓ATC XmnI GAANN↓NNTTC
3. 非对称突出端
① 来自非对称识别序列 CCTCAGC GGAGTCG BbvCI
② 简并序列
AccI GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC GT/MKAC
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5’甲基-胞嘧啶
④ 其它
SalI AccI HincII G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
4、限制性内切酶的分类：
第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：
如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较 大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子
第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000-100000)，作用时需Mg++存在
III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：
切点不专一，往往不在识别位点内部。
NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麦格； TakaRa.
二、限制酶的识别序列
1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。
4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率
6 碱基酶 稀有切割限制酶 2、识别特定碱基顺序： 2、1 回文对称序列（ palindrome，从两个方 向阅读其序列相同的序 列）。
③ 间隔序列
DraIII CACNNNGTG
EarI
CTC T TC (1/4) GAGAAG
4. 同裂酶 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多 种限制酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同
KpnI SstI GGTAC C CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG
第二章 分子克隆工具酶
切割位点可为获得DNA的物理图的 特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊 DNA片段的能力使得纯化那些DNA 片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 修饰酶
R=A or G M=A or C S=C or G
Y=C or T K=G or T W=A or T
H=A or C or T
V=A or C or G
B=C or G or T
D=A or G or T
N=A or C or G or T
EcoRI
5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
GACGT/C
GR/CGYC
来自百度文库
③ “同功多位” EcoRI ApoI HpaI HincII G/AATTC R/AATTY GTT/AAC GTY/RAC
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位 点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
例如：Hin d Ⅲ
Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌），
ｄ：表示菌系为ｄ型血清型； Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上 Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I(II)—Streptomyces achromogenes I (Ⅱ)
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 细胞提取液可降解E.coli DNA
CC↓TCAGC GGAGT↑CG Bbvc I
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC 3’-GGG GGG-3’ CCC-5’