第二章：分子克隆的工具酶.
基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
40
第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
29
第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
基因工程复习总结
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
第三章分子克隆载体
1.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源，而不影响其本身的复制;
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。
引物有哪些基本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1的片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16，通常为18-30，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体
····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2.简述利用T7噬菌体启动子的系列表达载体的工作原理。
····3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？
黏粒的优点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
第二章 (用)分子克隆工具酶
W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
第二章 分子克隆工具酶题目
第二章分子克隆工具酶一、选择题1.有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切二、填空题1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端，则可以用__________进行3‟末端标记。
如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3‟末端标记。
2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。
三、判断题1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。
pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。
同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（）四、名词解释1. DNA聚合酶2. 限制性内切酶3. 甲基化酶4. T4-DNA连接酶5. 核酸酶6. Klenow酶7. T4 DNA聚合酶8. Taq DNA聚合酶9. 逆转录酶10. 同裂酶11. 核酶五、简答题1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？3.简述Klenow聚合酶的用途。
4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。
5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓，限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。
在质粒上有酶I 的1个切点，在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。
用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。
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2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 细胞提取液可降解E.coli DNA
CC↓TCAGC GGAGT↑CG Bbvc I
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC 3’-GGG GGG-3’ CCC-5’
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5’甲基-胞嘧啶
III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：
切点不专一，往往不在识别位点内部。
NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麦格； TakaRa.
பைடு நூலகம்
二、限制酶的识别序列
1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。
4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率
6 碱基酶 稀有切割限制酶 2、识别特定碱基顺序： 2、1 回文对称序列（ palindrome，从两个方 向阅读其序列相同的序 列）。
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
例如：Hin d Ⅲ
Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌），
ｄ：表示菌系为ｄ型血清型； Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上 Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I(II)—Streptomyces achromogenes I (Ⅱ)
在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIII GG↓CC EcoRV GAT↓ATC XmnI GAANN↓NNTTC
3. 非对称突出端
① 来自非对称识别序列 CCTCAGC GGAGTCG BbvCI
② 简并序列
AccI GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC GT/MKAC
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
③ 间隔序列
DraIII CACNNNGTG
EarI
CTC T TC (1/4) GAGAAG
4. 同裂酶 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多 种限制酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同
KpnI SstI GGTAC C CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG
4、限制性内切酶的分类：
第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：
如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较 大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子
第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000-100000)，作用时需Mg++存在
第二章 分子克隆工具酶
切割位点可为获得DNA的物理图的 特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊 DNA片段的能力使得纯化那些DNA 片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 修饰酶
R=A or G M=A or C S=C or G
Y=C or T K=G or T W=A or T
H=A or C or T
V=A or C or G
B=C or G or T
D=A or G or T
N=A or C or G or T
EcoRI
5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
① 同序同切 这些酶识别序列和切割位置都相同 HindII HincII GTY/RAC
HpaII
MobI
HapII
Sau3AI
C/CGG
/GATC
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同
KpnI Acc65I
GGTAC/C G/GTACC
Asp718I G/GTACC
AatII
BsaHI
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
④ 其它
SalI AccI HincII G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
GACGT/C
GR/CGYC
③ “同功多位” EcoRI ApoI HpaI HincII G/AATTC R/AATTY GTT/AAC GTY/RAC
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位 点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。