分子克隆的工具酶

② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同
KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACC
AatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC
③ “同功多位”
EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTY
HpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC
二、限制酶的识别序列
1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。
4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率 6 碱基酶 稀有切割限制酶
2、识别特定碱基顺序： 2、1 回文对称序列（ palindrome，从两个方 向阅读其序列相同的序 列）。
R=A or G M=A or C S=C or G H=A or C or T V=A or C or G N=A or C or G or T
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤
YR
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000-100000)，作用时需Mg++存在
III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：
切点不专一，往往不在识别位点内部。
NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麦格； TakaRa.
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
第二章 分子克隆工具酶
切割位点可为获得DNA的物理图的 特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊 DNA片段的能力使得纯化那些DNA 片段成为可能
获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 Biblioteka Baidu饰酶
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位 点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。
④ 其它
SalI AccI HincII
G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
E.coli K
K B C
E.coli B E.coli C
E.coli K
K 1 B 10-4 C 10-4
E.coli B
10-4
E.coli C
1
1
1
10-4
1
说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5’甲基-胞嘧啶
XmnI GAANN↓NNTTC
3. 非对称突出端 ① 来自非对称识别序列
CCTCAGC BbvCI GGAGTCG
② 简并序列
AccI
GT/MKAC
GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC
③ 间隔序列
DraIII CACNNNGTG
EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG
Y=C or T K=G or T W=A or T B=C or G or T D=A or G or T
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ CC↓TCAGC 3’-C T T A A G-5’ GGAGT↑CG
Bbvc I
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
EcoRI
3. 限制酶的命名
• 宿主 属名第一字母、种名头两个字母 • 菌株或型号 • 序号 罗马字
HindII EcoRI
例如：Hin d Ⅲ Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌），
ｄ：表示菌系为ｄ型血清型； Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI—Escherichia coli RI
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶
需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA
4. 同裂酶
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
① 同序同切 这些酶识别序列和切割位置都相同
HindII HincII GTY/RAC HpaII HapII C/CGG MobI Sau3AI /GATC
EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上
Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I(II)—Streptomyces achromogenes I (Ⅱ)
4、限制性内切酶的分类：
第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：
如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较 大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子