分子克隆的工具酶
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
第二章 分子克隆工具酶3.8
1962年W. Arber提出,菌体中含有2种以上功能 不同的酶：
1. 核酸内切酶：能识别切断外来DNA分子的某 些部位，使其使去活性，限制外来只菌体的繁 殖——限制性核酸内切酶；菌体的防御系统。
2. 修饰酶：也能识别限制性内切酶所识别的 序列，并把某些 C 或 A 甲基化，使其不被 RE 降 解——菌体保护自身DNA系统。
(2)同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其 识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产
生相同的黏性末端，例如BamH I(GGATCC)。同
尾酶产生的DNA片段能通过黏性末端之间的互
补作用而彼此连接起来，但重组后形成的序列
再也不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
同尾酶
Sau3A I GATC CTAG BamH I GGATCC CCTAGG
4.切割后产生平头或黏性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口
1. 平头末端 (blunt end) 即在识别序列的对 称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列为5’GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2.黏性末端(cohesive end) 即在识别序列的 两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链 尾巴的切口。黏性末端又可分为两种：从DNA 分子5’端切割产生5’端突出的黏性末端称为 5’黏性末端．如EcoRI；从3’端切割产生3’ 端突出的黏性末端称为3’黏性末端，如Pst I。
第三节
DNA 聚 合 酶
DNA聚合酶
(DNA polymerase)
在细胞内的DNA复制过程中起着重要的作用。 它们通常被分为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ三类。 DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶。 基因工程中常用的DNA聚合酶有： 大肠杆菌聚合酶I(全酶)；
第三章 分子克隆工具酶
常用的工具酶
主 要 功 能
(续上表格)
工具 酶 名 称
碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
2.1.5 同尾酶
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这 些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割 DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoRⅠ G↓AATTC SpeⅠ A↓CTAGT T↓CTAGA BamHⅠ G↓GATCC
常用分子克隆工具酶简介
精品医学ppt
43
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
四种不同补平反应
BamHI
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
dNTP
dGTP dGTP/dATP
5’-GGATC 5’-GG 3’-CCTAG 3’-CCTAG
5’-GGA 3’-CCTAG
dGTP/dATP/dTTP
klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
精品医学ppt
12
1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：
的 RNA区域
精品医学ppt
41
1.2 RNase H
特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA 部分，产生不同长度的具有3’OH和5‘P端的 寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA （或RNA).
精品医学ppt
42
切平反应和补平反应
5’—AAGCTT—3’ HindIII 5’—A AGCTT—3’
λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析
精品医学ppt
34
5'
S1核酸酶活性
5' 5'
ExoIII
5' S1
S1
Poly(A) S1
Poly(A)
精品医学ppt
S1 5'
S1
S1
5'
35
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
第二章 分子克隆工具酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的 3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯 键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形 成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现 的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.
应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切 酶。
(1) 基本特性
识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的 为6个碱基. 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序 列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如 Sma I (CCC ↓GGG)
限制性核酸内切酶的反应条件
2) 反应系统因素
缓冲液（无菌、无污染） 金属离子 如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如 HindⅢ，ECORI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 牛血清蛋白(BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化 学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾
物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1
单位。
(3)限制性核酸内切酶的反应条件
1)底物 DNA
DNA纯度:
RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h
1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl
噬菌体T4DNA连接酶
分子克隆工具酶
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修 饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别 切割。
① Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。
② Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个 C上C5位置上引入甲基。
ATP、Mg2+、 SAM GAGCC CAGCAG
距识别序列下游 24-26bp处
I型限制性内切酶
I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两 种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和 DNA解旋酶4种活性。
显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。
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5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤
YR
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
4. 同裂酶
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
① 同序同切 这些酶识别序列和切割位置都相同
HindII HincII GTY/RAC HpaII HapII C/CGG MobI Sau3AI /GATC
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位 点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。
④ 其它
SalI AccI HincII
G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶
需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000-100000)，作用时需Mg++存在
III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：
切点不专一，往往不在识别位点内部。
NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麦格； TakaRa.
EcoRI
3. 限制酶的命名
• 宿主 属名第一字母、种名头两个字母 • 菌株或型号 • 序号 罗马字
HindII EcoRI
例如：Hin d Ⅲ Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌），
ｄ：表示菌系为ｄ型血清型； Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI—Escherichia coli RI
E.coli K
K B C
E.coli B E.coli C
E.coli K
K 1 B 10-4 C 10-4
E.coli B
10-4
E.coli C
1
1
1
10-4
1
说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5’甲基-胞嘧啶
二、限制酶的识别序列
1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。
4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率 6 碱基酶 稀有切割限制酶
2、识别特定碱基顺序： 2、1 回文对称序列（ palindrome，从两个方 向阅读其序列相同的序 列）。
R=A or G M=A or C S=C or G H=A or C or T V=A or C or G N=A or C or G or T
Y=C or T K=G or T W=A or T B=C or G or T D=A or G or T
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ CC↓TCAGC 3’-C T T A A G-5’ GGAGT↑CG
Bbvc I
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
XmnI GAANN↓NNTTC
3. 非对称突出端 ① 来自非对称识别序列
CCTCAGC BbvCI GGAGTCG
② 简并序列
AccI
GT/MKAC
GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC
③ 间隔序列
DraIII CACNNNGTG
EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上
Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I(II)—Streptomyces achromogenes I (Ⅱ)
4、限制性内切酶的分类：
第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：
如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较 大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子
第二章 分子克隆工具酶
切割位点可为获得DNA的物理图的 特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊 DNA片段的能力使得纯化那些DNA 片段成为可能
获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 修饰酶
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同
KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACC
AatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC
③ “同功多位”
EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTY
HpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC