4常用分子克隆工具酶简介
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
分子克隆中的工具酶
Alu Ⅰ 5’ NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNN 3’
二、限制性核酸内切酶的分类
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修 饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大 类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位 点25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
5’
3’
2) 3’-粘端的末端标记
先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其补 平，在高浓度的dNTP条件下，使3’-端的外切反应与dNTP 的搀人反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸， 即可使产物成为3’-末端带标记的DNA。
核酸外切酶
5’
G CA AT G C T T A G C CA T C G T TA C G A A T C G G T A 5’
限制性核酸内切酶
5’
G CA AG C T T T A G C CA T C G T T C G A A A T C G G T A 5’
限制性核酸内切酶
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的 断裂,产生相应的限制性DNA片段。
5’ 3’
3’
5’裂解 变性ຫໍສະໝຸດ 显影3 合成cDNA的第二链
3’
5’
cDNA
5’ 3’
二、Klenow 酶
1 随机引物标记核酸探针
2 5’-粘端补平或3’端标记
3 合成cDNA的第二链
4 DNA序列分析 5 3’-端的末端标记
N端
大肠杆菌DNA聚合酶 I
木瓜蛋白酶
C端
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
40
第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
29
第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
分子生物学重点知识总结
分子生物学一、名词解释1.ORF答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。
在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。
2.结构基因答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。
3.断裂基因答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。
真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。
4.选择性剪接答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。
5.C值答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。
6.生物大分子答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。
常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
7.酚抽提法答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。
8.凝胶过滤层析答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
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3'-末端补齐 3'-末端标记
5' -ACGTTGCAA ACTG -3' 3' -TGCAACGTTTGAC…..5'
cDNA第二链合成
mRNA 3' -UGCAACGUUUGAC…..5' c DNA 5' -ACGTTGCAAACTG
GAC
5' 3' 5'
5' ~~ 5'
5' ---------~~ 5'
DNaseI 与 Pol I 的 切口移位
HO P 5' 3' 5' 3'
DNaseI Pol I
5' 3'
1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌
蛋白酶水解产物。
活性：5' ? 3' 聚合酶 3' ? 5' 外切酶
用途：
⑴ 3' -末端补平 ⑵ 3' -末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序
1.3 DNase I
用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
聚合酶活性 dNTP
用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应
1.4 Taq DNA polymerase
特点：
分离自水生栖热菌，分子量为 94,000，最适反应 温度75-80℃ 。
5' -3' 聚合酶活性 5‘-3' 外切酶活性
用途：
主要用于 DNA的体外扩增
5' 3'
5'
5' 3' 3'
2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端
2.2 大肠杆菌 DNA ligase
dsDNA 的黏性末端和平末端
3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活
3' 5'
热变性
3' 3'
5'
随机引物 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~
退火
3' 3'
5'~~ 5'
? -32PdNTP
Klenow 酶
3' 3'
5' 5'~~ -------
1.3 T4 DNA polymerase
特点：
5' →3' 聚合酶活性 3'→5' 外切酶活性
外切酶活性 无dNTP
Taq Pol 和PCR
3' 变性 5'
5'
3'
3'
5'
3' 5' 引物 3'
延伸 5'
5'
3'3ຫໍສະໝຸດ 引物 5' 复性3' 5' 3' 5'
1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途：
⑴ cDNA第一链的合成 ⑵补平反应 ⑶用于DNA测序
第三节 DNA 修饰酶
1.1 末端转移酶（TdT ）
因子
3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口
4 影响DNA ligase 连接反应的因素
4.1 温度
黏性末端 4-15℃
平末端
10-20℃
4.2 连接酶浓度
平末端 1-2个单位
黏性末端 0.1个单位
4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端
第二节 DNA 聚合酶和反转录酶
DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下， 把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链 DNA分子引物链的3′-OH 末端，催化 核苷酸的聚合作用。
1 DNA polymerase分类
依赖于DNA的DNA聚合酶:
Ecoli DNA polymerase I
klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
常用工具酶简介
第一节 DNA连接酶(DNA ligase)
1 DNA Ligase 1.1 概念 1.2 分类
根据连接反应时所需能量辅助因子的不同： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase
按照来源分： T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase
1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类： DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ
DNA pol I特性： ⑴ 5‘-3'DNA聚合酶活性 ⑵ 3‘-5'外切酶活性 ⑶ 5‘-3'外切酶活性 （切口平移）
DNase I 作用特点
Mn 2+存在时
Mg2+存在时
⑴ 反应特点
在酶的催化下将 dNTP 加到DNA分子的3‘OH末 端，催化作用不需要模板。
⑵ 用途
3' -加尾，便于两 DNA分子重组 3' -末端标记
1.2 T4 多聚核苷酸激酶
催化反应： 正向反应 催化5‘-OH 末端的磷酸化
交换反应
5' P 3'HO
OH 3' P 5'
5' 32P
[γ-32P]ATP 3' HO
λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA 结构分析
5'
S1核酸酶活性
5' 5'
ExoIII 5' S1
S1
Poly(A) S1
Poly(A) S1 5'
S1
S1 5'
1.2 Bal 31 核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性，可 从3‘O端H 降解DNA。对于L-DNA，它表现 3'-5‘的外切酶活性和5'-3‘的外切酶活性，可 又有控制地从3'端和5‘端逐个水解除去单核 苷酸，产生缩短了的DNA分子。
OH 3'
ATP
32P 5'
1.2 T4 多聚核苷酸激酶
用途： 1) DNA或RNA的5' 末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5' -磷酸基末端，
便于连接酶反应
1.3 碱性磷酸酶
用途
1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加 重组频率
2) 5' 端 核酸末端标记
碱性磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶活性
5' P 3'HO
OH3' 5'HO
I
P 5'
3'HO
OH3' OH5'
5' P
II
3'HO
OH 3' P 5'
第四节 外切核酸酶
1 外切核酸酶概念 2 分类
按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶
第五节 单链内切核酸酶
1.1 S1核酸酶
特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII 、