分子克隆酶
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
29
第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
第二章 (用)分子克隆工具酶
W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆又称“定向酶促融合”，是一种新型的微生物发酵技术。
它以生物学特性为基础，使用带有正电荷的生物导向剂进行定向扩增，再把含有该正电荷生物导向剂的细胞裂解液体与细胞固体分离开来，并将细胞固体保留在无菌管内，只是把细胞裂解液体与细胞导向剂混合在一起；然后利用酶切或其他方法将含有某一特殊酶切位点的导向剂片段或其他标记单位置于目的基因的两端，使这些单位被带有特定正电荷的生物导向剂定向吸引到相应的基因上，使得基因表达合成目的蛋白质，由此而制备目的基因的表达产物。
分子克隆的基本原理是利用核酸碱基对，通过磷酸二酯键、糖苷键、疏水键和氢键的形成，或同核苷酸链接等连接方式，将两个核酸分子结合在一起，形成长度足够的片段，以实现目的基因在特定位点上的高效表达。
简言之，就是利用核酸连接酶，把两个DNA分子的长链分解成为几个小片段，通过酶的催化作用，使这些小片段连接成较大的分子，从而获得不同长度的核酸分子，使这些小片段能够携带某些特定的遗传信息，转入所需的细胞中去，并在适当的条件下，使它们表达出相应的功能性产物。
分子克隆技术可用于发酵工业的重组菌株的构建，这一技术的应用，能将工业上不易获得的，甚至不可能获得的工业菌种或经济价值很高的生物大分子，迅速地大量生产出来，以满足人类社会的需要。
不论是从数量上还是质量上，都具有显著的优势。
分子克隆技术已广泛应用于酶、抗体、激素、核酸、氨基酸、抗菌肽等生物大分子的生产，如用基因克隆技术培育的小鼠生长素基因，每只小鼠用量只需0．01微克。
一个小鼠一年就可生产近30万单位的生长素。
利用基因克隆技术生产的胰岛素，每人一天仅需2单位，而且纯度高、活性强。
此外，有关基因克隆还被用于生产除草剂、抗病毒和抗肿瘤的药物，甚至还可以利用基因克隆技术改变动植物的遗传性状。
人们常说，科学的春天是创造的春天，创造性思维才是科学研究的真正源泉。
随着生命科学的发展，将给人类健康带来新的希望。
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
下面将详细介绍分子克隆的实验流程。
1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。
这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。
2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。
常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。
将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。
3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。
这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。
4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。
在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。
此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。
PCR检测可以验证目标基因的存在。
5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。
这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。
只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。
选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。
6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。
通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。
提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。
7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。
这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。
通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。
8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。
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1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
2006-02-21
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases Nicking Enzymes Control Proteins Specificity Subunits 74 33 36 78
Distinct Specificities: prototypes Type I REs 34 Type II REs 259 Type III REs 5 Homing Endos 58 Type II Methylases 189 Orphan Methylases 23 Type IV 0 total 68 3692 10 74 625 109 3
Restriction Enzymes
Type I Type II Type III Methyl-Directed 49 3470 10 4
3529
/
2003
Enzymes:
Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631
Methylases 696 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases 62 Nicking Enzymes 22 Control Proteins 33 Specificity Subunits 59
获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰(restriction an modification) 二、限制性内切酶识别的序列
三、限制性内切酶产生的末端 四、末端长度对切割的影响 五、位点偏爱 (site preferences) 六、酶切反应条件 七、星星活性(star activity) 八、单链DNA的切割
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现寄主控制的专一性( host controlled specificity) 噬菌体表现的现象具有代表性和普遍性
其在不同宿主中的转染频率：在感染某一宿
主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象
1. 现象
/cgi-bin/statlist Restriction Enzymes 3773 Type I 68 Type II 3692 Type III 10 Type IV 3 Weirdo REs 1 Putative REs 1939 --------------------------------Methyltransferases 810 Type I 64 Type II 625 Type III 12 Orphan Methylases 109 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 3283
分子克隆酶
第二章 分子克隆工具酶
Enzymes used in molecular cloning
切 割 位 点 可 为 获 得 DNA 物 理 图 (physical map)的特殊标记 利 用 限 制 性 内 切 酶 (Restriction endonuclease) 切割产生特殊 DNA 片 段的能力使得纯化那些 DNA 片段成 为可能
Commercial Availability:
2002 2003
Restriction Enzymes: 583 568 Methylases: 18 17 Homing Endonucleases: 6 5 Nicking Enzymes: 7 8 Distinct Type II RE specificities: 207 213
pfu plaque forming unit 空斑形成单位 EOP Efficiency of plate 感染率
E. coli K
EOP=10-4
EOP=1
EOP=1
E. coli C
Байду номын сангаас
EOP=1
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基-胞嘧啶
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
• 人的免疫系统(immunity system)
• 细菌的限制与修饰系统
(restriction and modification system)
限制性内切酶 修饰酶(modification enzyme)
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
早前 加R, or M 菌株号和序号小写 1986年下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性