分子克隆工具酶及其应PPT课件
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第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)
噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
《分子克隆中所用酶》PPT课件
识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
精品医学
2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
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3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
精品医学
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E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
精品医学
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recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
分子克隆ppt课件
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重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
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cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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LOGO
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3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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5
分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件
提取(尽可能大)
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
分子克隆常用工具酶ppt课件
;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
;.
50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
;.
24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
;.
25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。
第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件
5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
分子克隆工具酶_图文(精)
第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。
60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。
到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA 技术中有重要地位，在此较详细介绍。
第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。
这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。
在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。
分子克隆工具酶-13级幻灯片
Байду номын сангаас
甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶
Dam甲基化酶
可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基
当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用damE.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5 位置上引入甲基
EcoKⅠ甲基化酶
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反响需Mg2+、 ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 Ⅱ型酶 (占90%以上) 分子量较小，反响只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称构造，切割位点在回文对 称构造上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端 Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
同尾酶 可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进展互补连接。 EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限 制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量
的核苷酸，否那么难以发挥切割活性。
一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常
规的酶切需要。
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶
Dam甲基化酶
可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基
当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用damE.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5 位置上引入甲基
EcoKⅠ甲基化酶
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反响需Mg2+、 ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 Ⅱ型酶 (占90%以上) 分子量较小，反响只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称构造，切割位点在回文对 称构造上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端 Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
同尾酶 可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进展互补连接。 EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限 制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量
的核苷酸，否那么难以发挥切割活性。
一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常
规的酶切需要。
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
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５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 2021/3/7 3’-CTTAAG-5’
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制
酶谱。
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二 . 限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction
modification and specificity）位于染色体上，三
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分
子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种
末端2可021/以3/7 相互连接。
10
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
七. 1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
2302.1/3星/7 反应的利用和避免
分子克隆工具酶及其应用
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分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：2M021n/+3+/7代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
11
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5, 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATHTOGC--538’’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制
酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
Hi2n02d1/3Ⅲ/7 —Haemophilus influensae d Ⅲ
6
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组
分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率
只有1/16。
BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不 能为两种酶所识别和酶切。
个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、
SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.
coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基
因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具
化、检测等。
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2
第一节
限制性内切核酸酶
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3
一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I 型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血 杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
CCGGN’N’N’N’N’CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突
起
２2021）/3/7 富含ＧＣ
7
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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５）相容性末端
如：BamHI
G GATCC
BglII
A GATCT
MboI, Sau3AI N GATCN
有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于
基20因21/3/工7 程中。
5
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；
狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、
菌系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种
名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型