分子克隆常用工具酶演示文稿
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第二章 (用)分子克隆工具酶
W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
第二讲(1) 分子克隆工具酶—限制和修饰
1 限制酶的发现
20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之 间的限制现象与不受限制现象， 60年代提出 对上述现象解释的假设: 内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点 使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶 类。
λ噬菌体不同感染株对E.coli不同菌株的感染率
λ噬菌体感染率 E.coli菌株 λ（K） λ（B） λ（C）
由于限制酶要求严格的识别和切割 序列，在一段不大的DNA片段中，酶切 位点是不多的，酶切产物片段的大小和 数目也是固定的。 此特性可用于鉴定酶种类和活性测 定，也用于鉴定DNA片段是否有同源性， 或有无变异。
6 同裂酶（isoschizomer ） （
定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 特点： ） 特点：1）识别序列相同 2）切割位点可能不同 ） 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 Hind II与Hinc II GTY/RAC 与 Hpa II与HpaII C/CGG 与 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC
根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。
偶数序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其两侧 的核苷酸。 NGCN NATN NCGN NTAN 奇数序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找 其两侧的核苷酸。 NGNC N NANTN NTNAN NCNGN N代表任意碱基。
一般说，在同一个DNA分子中，识别序列 短的出现的概率大，反之概率小。 原则上有n个碱基的识别序列的出现概率 是1/4n 。 如Sau 3A 识别序列GATC，间隔256(44) 个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。 E. coR I GAATTC ？？
《分子克隆中所用酶》PPT课件
识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
精品医学
2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
精品医学
3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
精品医学
15
E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
精品医学
16
recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
分子克隆技术常用的工具酶
经修饰的DNA不再被限制酶降解。
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件
提取(尽可能大)
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤
分子克隆常用工具酶ppt课件
;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
;.
50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
;.
24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
;.
25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。
分子克隆工具酶及其应用
命名
EcoR I
Escherichia coli RY13株
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制酶的特点
识别顺序和酶切位点 ---识别4~8个相连的核苷酸
限制酶的用途
• DNA重组 • 限制酶（物理）图谱绘制 • 突变分析（RFLP分析）
几个在分子克隆中应注意使用内切酶：
Dpn I:
CH3
GA TC CT AG
Sap I: GCTCTTCNNNN CGAGAAGNNNN
CH3
DNA 甲 基 化 酶
(DNA Methylase)
甲基化酶的种类与识别顺序
--切点大多数在识别顺序之内，也有例外
--限制酶切后产生两个末端: 5’-P和3’-OH
3’-端突起
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
5’-端突起
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
5’-CTGCAOH 3’-GP
5’-GOH 3’-CTTAAP
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC
GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG
GATCGA TCTAGATC
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm
RE
RE
RE
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件
5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae
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常用的工具酶性质及功能
工具酶名称
限制性内切核酸酶 Restriction endonucleases
DNA连接酶 DNA ligase
DNA聚合酶I DNA polymerase I
多核苷酸激酶 DNA polymerase kinease
反转录酶 Reverse transcriptase
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
Bam HⅠ
5`---G
GATC C---3`
3`---C CTAG
G---5`
5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5`
Bgl II
5`---A
GATC T---3`
3`---T CTAG
A---5`
四、影响酶切反应的条件*
① 温度：一般37℃ ② 盐离子浓度：Na＋，Mg2＋ ③ 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的Tris-HCl缓冲体系 DTT用于保持酶
位点偏爱（site preference）
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 为7bp～8bp，甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
不同限制性内切酶切割的三种结果
同尾酶
5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5`
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
第一节 分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 子。
限制性内切酶 Restriction enzymes
Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中 分离到的第3个限制酶。
三、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复
冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
分子克隆常用工具酶演示文稿
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
Replication
分子克隆操作过程：
克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割 和连接，制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定 →扩增和表达。
工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、 聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来， 需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需 要 DNA 聚合酶（polymerase）等。
降解酶 S1 nuclease S1
Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整 体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即 5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、 低离子强度、极端ppH值等，会使一些核酸内切 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*： AATT ；Ec。
名
属种 株序
称
名 名名 号
EcoRⅠ E co R Ⅰ
Hind Ⅲ H in d Ⅲ
HindⅡ H in d Ⅱ
HpaⅠ H pa / Ⅰ
菌株来源
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
稳定性和活性 ④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在-20℃ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度 过高，影响酶切反应 ⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 ⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 置会影响酶切反应。
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
一、限制性核酸内切酶的分类
二、 限制性核酸内切酶的命名原则
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶