胃蛋白酶亲和有机聚合物毛细管整体柱的制备及性能考察
牛血清白蛋白亲和毛细管整体柱的制备及色氨酸对映体的分离
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高效毛细管电泳色谱仪有机基质整体柱制备
高效毛细管电泳色谱仪有机基质整体柱制备高效毛细管电泳色谱仪有机基质整体毛细管柱是采用柱内直接键合的方法在毛细管中进行原位自由基聚合反应，形成连续床固定相，不用柱塞，简化了柱制备过程。
通过改变单体可引入多种官能团，有更好的多孔性和渗透性，对流动相阻力小，溶质在固定相和流动相之间快速分配，有利于实现高速分离。
有机基质整体毛细管柱有以聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯为基质的整体柱。
典型的聚合液以含一个乙烯基的化合物为单体，以含两个乙烯基的化合物为交联剂，以含离子基团的化合物为产生电渗流的单体，为了形成多孔结构往往添加致孔剂。
有机基质整体毛细管柱种类比较单一，机械强度较差，容易发生收缩和溶涨现象，使柱性能发生变化，影响柱寿命。
一、聚丙烯酰胺基质整体毛细管柱制备：以聚丙烯酰胺为基质的整体柱从1995年首次出现以来得到了广泛应用。
最初的整体柱一般以丙烯酰胺为单体，以亚甲基二丙烯酰胺为交联剂，以含离子基团的化合物为产生电渗流的单体，所得到的整体柱是亲水性较强的柱床。
为了获得疏水性较强的柱床，可添加疏水性较强的单体，如十四烯、十六烯和十八烯等，利用反相机制进行分离。
二、聚甲基丙烯酸酯基质整体毛细管柱制备：以聚甲基丙烯酸酯为基质的整体柱是硬质柱床，柱制备比较简单，毛细管壁可不经过预处理将聚合物混合液引入到柱中后，经水热处理可得到柱体与管壁结合很好的整体柱。
以2－（三甲基磺酸甲酯铵）乙基甲基丙烯酸酯（MEAMS）为单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，以正丙醇和1，4－丁二醇的混合液为致孔剂，可得到具有反相和离子交换混合模式的整体柱。
MEAMS中的铵基既作为产生反向电渗流的基团，又作为强离子交换固定相。
该整体柱对中性化合物表现出反相色谱机制，对带电荷的物质既有反相作用机制，又有离子交换作用机制。
使用该整体柱分离碱性化合物时，还消除了一般电泳和电色谱中由于碱性化合物吸附所造成的峰拖尾现象。
三、聚苯乙烯基质整体毛细管柱制备：以聚苯乙烯为基质的整体柱是硬质整体柱。
聚十二烷基甲基丙烯酸酯整体柱的制备及其在毛细管电色谱法分离肌红蛋白酶解产物中的应用
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亲水作用毛细管整体柱的制备及其用于奶制品中三聚氰胺的加压毛细管电色谱分析
亲水作用毛细管整体柱的制备及其用于奶制品中三聚氰胺的加压毛细管电色谱分析李新燕;王彦;谷雪;陈妍;阎超【摘要】以甲基丙烯酸丁酯(BMA)和3-[N,N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐(SPE)为单体,制备了新型的亲水作用毛细管整体柱,并通过三聚氰胺在此柱上的保留行为证明其具有亲水性.以加压毛细管电色谱(pCEC)技术为平台,优化了整体柱基于亲水作用分离分析奶制品中三聚氰胺的色谱条件.当流动相中乙腈与10 mmol/L 磷酸盐缓冲液的体积比为80:20,pH为3.0,电压为 3 kV,检测波长为215 nm时,三聚氰胺能获得很好的分离.方法学考察结果表明,合成的亲水整体柱具有良好的重现性和渗透性,建立的pCEC分析方法的检出限为0.05mg/L.该方法简单方便,回收率较高,而且流动相中无需添加离子对试剂,适合于奶制品中三聚氰胺的定量测定.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2010(028)003【总页数】5页(P231-235)【关键词】亲水作用毛细管整体柱;制备;加压毛细管电色谱;三聚氰胺;奶制品【作者】李新燕;王彦;谷雪;陈妍;阎超【作者单位】上海交通大学药学院,上海,200240;上海交通大学药学院,上海,200240;上海交通大学药学院,上海,200240;江苏泰州市产品质量监督检验所,江苏,泰州,225300;上海交通大学药学院,上海,200240【正文语种】中文【中图分类】O658Abstract:The hydrophilic monolithic column was preparedin100μmi.d.capillary in situ using ethylene dimet hacrylate as crosslinker,butyl methacrylate and3-[dim ethyl-[2-(2-methyl prop-2-enoyloxy)ethyl]azaniumyl]propane-1-sulfonate as monomers.In the study,the hydrophilic interaction behavior of the monolithiccolumn was demonstrated.The application of the column in pressurized capillary electro Chromatography(pCEC)for the separation of melamine with ultraviolet detection has been studied.The effects of the com position of mobile phase,pH value,the concentration of the buffer,the flowrate of pump and voltage were investigated.The optimum separation for melamine was achieved with the mobile phase of10mmol/L phosphate buffer(pH3.0)and acetonitrile(20∶80,v/v),voltage at 3kV and UV detection at215 nm.The limits of detection(LOD s)(S/N=3)for melamine standard was0.05m g/L.The method is simple,accurate and works well without using the ion-pairing agent.The powdered milk and liquid m ilk were analyzed quantitatively by pCEC using the hydrophilic interaction monolithic column.It is show n that this method is promising in the routine analysis of melamine in dairy products.Key words:hydrophilic interaction capillary monolithic column;p reparation;pressurized capillary electroChromatography(pCEC);melamine;dairy products整体柱(monolithic column)是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相,又称为棒状柱、连续床层、无柱塞柱。
《β-环糊精组氨酸衍生物毛细管电色谱整体柱的制备及应用》
《β-环糊精组氨酸衍生物毛细管电色谱整体柱的制备及应用》一、引言毛细管电色谱（Capillary Electrochromatography, CEC）是一种结合了高效液相色谱和毛细管电泳的分离技术。
近年来，随着生物医药、环境监测和食品分析等领域的快速发展，对高效率、高灵敏度的分离分析技术提出了更高的要求。
整体柱是毛细管电色谱中的关键部分，它对提高分离效率和选择性起着重要作用。
本文旨在探讨β-环糊精组氨酸衍生物毛细管电色谱整体柱的制备方法及其在相关领域的应用。
二、β-环糊精组氨酸衍生物整体柱的制备β-环糊精组氨酸衍生物是一种具有优良生物相容性和亲和性的化合物，将其用于整体柱的制备，可以显著提高整体柱的分离效果和选择性。
1. 材料与试剂β-环糊精、组氨酸、化学交联剂、致孔剂等。
2. 制备方法（1）将β-环糊精与组氨酸进行衍生化反应，得到β-环糊精组氨酸衍生物；（2）将衍生化后的化合物与化学交联剂混合，制备成均匀的溶液；（3）将该溶液注入毛细管中，通过化学或光化学方法进行交联聚合，形成整体柱；（4）用适当的溶剂对整体柱进行清洗，去除未反应的物质和杂质。
三、整体柱的表征与应用1. 整体柱的表征通过扫描电镜（SEM）、能谱分析（EDS）等方法对整体柱的形态、孔径、化学结构等进行表征，以评估其性能。
2. 应用领域（1）生物医药：用于生物大分子的分离与纯化，如蛋白质、多肽等；（2）环境监测：用于环境样品中有机污染物的分离与检测；（3）食品分析：用于食品中添加剂、农药残留等的分析检测。
四、实验结果与讨论1. 实验结果（1）成功制备了β-环糊精组氨酸衍生物毛细管电色谱整体柱；（2）整体柱具有良好的形态和孔径分布，化学结构稳定；（3）在生物医药、环境监测和食品分析等领域取得了良好的分离效果和选择性。
2. 讨论β-环糊精组氨酸衍生物整体柱的制备方法简单、高效，且具有良好的生物相容性和亲和性。
在毛细管电色谱中，该整体柱可显著提高分离效率和选择性，为相关领域的分析检测提供了新的方法和手段。
光聚合法快速制备甲基丙烯酸酯类毛细管整体柱
Vo.l 29高等学校化学学报No .102008年10月 CHEM I CAL J OURNAL OF CH I NESE UN I VERSI T I E S 1969~1972光聚合法快速制备甲基丙烯酸酯类毛细管整体柱陈 娜1,张裕平2,张毅军2,叶雄文1,屈凌波1,袁倬斌3(1.郑州大学化学系,郑州450052;2.河南科技学院,新乡453003;3.中国科学院研究生院化学化工学院,北京100049)摘要 采用甲基丙烯酸正丁酯(B M A )为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA )为交联剂,正丙醇、1,4 丁二醇和水为致孔剂,Irgacure 1800为引发剂,在毛细管内采用光引发原位聚合150s 快速制备了有机聚合物整体柱.分别采用电色谱(CEC )、加压电色谱(p CEC)和低压色谱(LPLC)模式对所制备的整体柱进行了性能评价,基线分离了硫脲、甲苯、萘和联苯,在加压电色谱(p CEC )模式下硫脲的最低理论塔板高度达到了8 0 m.扫描电镜结果表明,整体材料在毛细管柱中形成并与毛细管内壁结合紧密.关键词 光聚合;整体柱;加压电色谱;甲基丙烯酸酯中图分类号 O 657 文献标识码 A 文章编号 0251 0790(2008)10 1969 04收稿日期:2007 12 11.基金项目:中韩国际合作项目(批准号:20611140646),河南省高校新世纪优秀人才(批准号:2006HNCET 01)及高校骨干教师项目资助.联系人简介:张裕平,博士,教授,主要从事色谱方法学应用研究.E m ai:l b eiji ng2008z yp@163.co m 整体柱(M ono lithic co l u m n )被称之为继多聚糖、交联与涂渍、单分散固定相之后的第四代分离介质,由于其通透性好,背压低,可以通过液相色谱、微流液相(纳流液相)及毛细管电色谱的方式实现样品的快速高效分离,因此近年来一直是国内外分离科学领域研究的热点[1,2].毛细管整体柱一般包括硅胶和有机聚合物两种基质,其中基于原位反应制备有机聚合物基质的色谱柱的过程,一般都通过常规加热、紫外光或微波引发的方式来完成[3].采用常规加热方法制备毛细管整体柱单体聚合反应时间长,紫外光引发聚合时间短,但必须使用昂贵的紫外透明的毛细管.外壁涂有聚四氟乙烯的石英管虽然紫外透明,但与毛细管结合不紧密,弹性差,且价格昂贵.本文采用三元致孔体系,在普通聚酰亚胺涂层的石英毛细管上实现了紫外光引发、快速制备整体色谱材料,分别使用毛细管加压电色谱(p CEC)、低压液相色谱(LPLC )及电色谱(CEC)模式对该聚合物毛细管整体柱进行评价,考察了不同电压和气压下芳香族衍生物的电泳和色谱行为.1 实验部分1.1 仪器与试剂Ag ilent 3DCE 电泳仪,配有二极管阵列检测器(DAD );Ag ilen t 1100型高效液相色谱仪;Quanta 200扫描电子显微镜(FE I ,H illsbo r o ,O regon ,U SA );Spetrolinker XL1500A 型紫外交联仪(Spectron i c s Corp .,W est b ur y ,NY,USA );熔融石英毛细管(75 m .i d .,375 m o .d.,河北永年光导纤维厂).甲基丙烯酸正丁酯(N e w Jersey ,用前用质量分数为5%的Na OH 萃取除去阻聚剂);乙二醇二甲基丙烯酸酯(N e w Jersey ,使用前用质量分数为10%的Na OH 萃取除去阻聚剂);2 丙烯酰胺 2 甲基丙磺酸(AM PS ,北京百灵威);Ir gacure 1800(C i b a);3 (三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯( M APS ,N e w Jersey ,USA );正丙醇、1,4 丁二醇、硫脲、甲苯、甲醇及乙腈(天津化学试剂公司);三羟甲基氨基甲烷(T ris)、萘和联苯(北京化学试剂公司);实验用水为二次蒸馏水;其余试剂均为分析纯.1.2 毛细管色谱整体柱的制备取2 7mL B MA 、1 5mL 交联剂ED MA 、0 024g 改渗剂AM PS 的功能单体混合物(质量分数为40%),将其加入到含0 6mL H 2O 、2 17mL 1,4 丁二醇和4mL 正丙醇的三元致孔剂中(质量分数为60%)组成混合溶液,室温下避光超声10m i n 后,加入0 04g 光引发剂Ir gacure 1800(质量分数为1%),再避光超声10m i n ,通氮气5m i n ,吸入到已处理过的长度为40c m 的毛细管(75 m .i d .)中.毛细管的预处理和烯基化过程参照文献[4]方法完成,吸入聚合溶液长度约为15c m ,两端用橡胶塞密封.在充聚合溶液的一端,用刀片以45度角在毛细管管壁上小心划出一条线形涂层,长约10c m,以使紫外光透过管壁,此时该10c m 毛细管仍存在大部分涂层,故仍能保持一定强度和较好的弹性,安装时必须小心操作.选定紫外交联仪的灯管波长为365nm ,控制一定的紫外剂量,室温下用紫外光照射150s ,溶液将在毛细管柱内发生原位自由基聚合反应.反应完成后,用甲醇在H PLC 泵的作用下冲洗约1h ,将未反应的单体、致孔剂、可溶性化合物冲洗出来.在未聚合端9c m 处烧去外层聚酰亚胺涂层,制得约2mm 左右的检测窗口.将此毛细管小心地装入毛细管电泳仪卡盒上,用流动相平衡1h ,逐步升高电压至30kV 后测定.1.3 电色谱实验所有电色谱实验均在毛细管电泳仪上进行.上机前将毛细管剪成总长为33c m,有效长度24 5c m,整体床层为10c m,数据采集和处理在H P Che m S tation 工作站完成,实验过程均采用p H =8 0的缓冲溶液50 50(体积比)ACN /2mm ol/L Tris 作为流动相,使用前经0 45 m 滤膜过滤.采用3种模式对硫脲、甲苯、萘和联苯的混合物进行分离.2 结果与讨论2.1 影响整体柱制备的因素通过紫外光引发聚合反应生成多孔交联聚合物[5,6],其中EDMA 作为交联剂连接一个用来分离的疏水性的B MA 单体和一个产生强电渗流的结构单元AMPS .引发方式以及引发剂的选择影响制柱的效率,水浴加热方式一般采用偶氮二异丁腈作为引发剂,聚合过程通常需要24h 才能完成[7~9].采用紫外光引发聚合过程通常要使用昂贵的紫外透明管,且聚合过程也要30m i n 左右[5,6].实验采用在普通Fig .1 R ep resen tation of a cap ill ary w ith a str i pe of the pol y i m ide coating re m oved in the m i dd le of the cap ill ary聚酰亚胺涂层的石英毛细管外壁上用刀片划一线形刻痕(图1中箭头所示),以便让紫外光透过,另外本实验所采用的光引发剂Ir gacure 1800引发效率高,它是由质量分数为25%的二(2,6 甲氧基苯甲酰) 2,4,4 三甲基戊基氧化磷和质量分数为75%的1 羟基环己基苯甲酮组成的混合物[10],该体系含有酰基膦和大量的酮类光引发剂,其协同作用使光聚合体系反应速度加快,且反应完全.本实验中整体柱制备的聚合过程在150s 内就可完成,形成的整体柱材料可以承受30M Pa 的压力而不被冲出;增加聚合时间虽然可以使聚合反应更加彻底,但太长的聚合反应又会使形成的整体柱材料孔径过密,通透性变差.2.2 整体柱色谱性能考察分别采用p CEC (分离时加电压,同时仅在毛细管入口端加1 2M Pa 气压)、CEC(即分离过程加电压,同时在电色谱毛细管两端加1 2M Pa 气压以防止气泡产生)、LPLC(分离时只在进口端施加0 6~1 2M Pa 气压)3种模式,对硫脲和3种苯环化合物进行了色谱性能评价,得到了3种模式的范氏方程(图2).实验结果表明,p CEC 操作模式出峰速度最快,在进口端保持1 2MPa 气压,同时操作电压在5~30kV 变化时,不被保留的中性物质硫脲的线形流速从2 59mm /s 增加到3 60mm /s .流速其次的1970高等学校化学学报 V o.l 29是LPLC 操作模式,在进口端气压由0 6M Pa 增加到1 2MPa 时,硫脲的线形流速从1 28mm /s 增加到2 40mm /s .出峰速度最慢的是CEC 操作模式,操作电压由5kV 增加到30kV 变化时,硫脲的线形流速从0 23mm /s 增加到1 44mm /s .采用p CEC 操作模式,可以实现物质的快速分离,这是由于物质在毛细管中的运动不仅受到电渗流作用,同时受压力驱动;另外,由于柱的通透性好,毛细管两端不加电压,仅在进口端采用较低的气压推动也可以实现4种有机小分子的快速分离;相比前两种模式,由于只有10c m 左右长度的整体柱床层产生双电层,床层后较长部分的毛细管由于烯基化没有电渗流,故CEC 模式中物质出峰速度最慢.3种操作模式对硫脲的最小塔板高度可分别在8 0,13 0和28 0 m 以下.4种有机小分子在3种模式下均可得到快速分离(图3),实验结果表明,所制备的毛细Fig .2 V an D ee m ter p l ots for the m onolith ic column in the m ode s of p CEC,CEC andLPLCC ap ill ary col umn,75 m .i d .,total lengt h =33c m,eff ecti ve lengt h =24 5c m,m onolit h l engt h =10c m;i n jection :20kV 5s .!p CEC;∀CEC;#LPLC.F ig .3 Chro m atogra m of aro m atic co m pounds on mono lith ic colu m n i n th e m odes of p CEC ,CEC and LPLC p CEC:12kPa(i n l et)+30kV;CEC:12kPa(i n let and outl et)+30kV;LPLC:12kPa(i n l et);214nm;25∃;peak i den tifi cati on(i n ord er of eluti on ):1.t h i ou rea ,2.t oluene , 3.naphthalene , 4.b i ph eny.l O ther cond iti on s are t h e sa m e as i n F i g .2.管电色谱整体柱表现出典型的反相色谱特征,中性物质的保留时间随其分子量的增大而延长.如果采用洗脱力更强的流动相,还可以获得更高的理论塔板数或更低塔板高度.为考察所制备的毛细管整体柱的稳定性及制备工艺的可控性,进行了柱内和柱间重现性实验,同样实验条件下连续进样8次,4种物质的保留时间的相对标准偏差在1 18%~1 91%范围.采用同样方法,控制毛细管整体床层的长度,制备3根毛细管色谱整体柱,4种物质的保留时间的相对标准偏差在6 38%~8 60%.结果表明,所制备的整体柱重现性好,制备工艺的可操作性强,容易控制.2.3 整体柱的结构表征聚合反应过程中致孔剂是聚合物整体柱产生贯通孔结构的先决条件,同时这种孔结构的存在是高效分离的保证.以1,4 丁二醇、正丙醇和水组成的混合物作为致孔剂,能够产生刚性的多孔结构.1,4 丁二醇、正丙醇与甲基丙烯酸正丁酯互溶,加入少量水能使亲水的AMPS 溶解,不同比例的致孔剂对整体柱的微观形态和孔隙有较大的影响,合适的致孔剂配比可获得良好的渗透性、均匀的孔径结构及高的柱效.实验参考热聚合法制备甲基丙烯酸酯类毛细管整体柱的配方,得到了床层均匀的固定相.扫描电镜结果(图4)表明,所形成的高分子材料与管壁结合紧密,没有脱落和缝隙,管内的整体材料具有致密的网络结构,网络骨架尺寸为1~2 m 左右,通孔为2~4 m 左右.Fig .4 SEM photopgraphs of the m ono lith ic col umn i n d ifferent magn ificat i on s1971 N o .10 陈 娜等:光聚合法快速制备甲基丙烯酸酯类毛细管整体柱1972高等学校化学学报 V o.l29该制备方法简单实用,可控制孔径以及整体材料在毛细管中的位置和长度,整体材料的机械强度高,柱渗透性好,是目前国内外制备毛细管整体色谱柱最快的方法之一.参 考 文 献[1] Svec F.,H uber C.G..Ana.l Che m.[J],2006,78:2100%2107[2] PI NG Gu i Chen(平贵臣).R esearch on Pol y m erM onolith i c S tati onary Ph ases for C ap ill ary E l ectrochro m atography[D],Dali an:Dali anInstit u t e of Ch e m ical Phys i cs,Ch i n ese Acade m y of S ci ence,2003[3] Z HANG Yu Ping(张裕平),Z UO Guo Q i ang(左国强),XU Guang R i(许光日),et a l..Che m.J.Ch i n ese Un i vers i ti es(高等学校化学学报)[J],2007,28(8):1445%1447[4] Zhang Y.P.,Gong W.J.,Zhang Y.J.,et a l..M i croch i m ica Acta[J],2007,158:353%360[5] Lee D.,Svec F.,Fr chet J.M.J..J.Ch ro m atogra.A[J],2004,1051:53%60[6] Eelti nk S.,H errero M arti n ez J.M.,Rozi ng G.P.,e t al..Ana.l Ch e m.[J],2005,77:7342%7347[7] YANG Jun Ji ao(杨俊佼),Z HANG K ai(张锴),GAO Ru Yu(高如瑜),et al..Che m.J.Ch i nes e Un ivers i ti es(高等学校化学学报)[J],2004,25(9):1654%1656[8] Sondergel d L.J.,Bu s h M. 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弱阳离子交换毛细管整体柱的制备与蛋白质分离
弱阳离子交换毛细管整体柱的制备与蛋白质分离摘要：以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，正丙醇、1,4丁二醇和水为致孔剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，在弹性石英毛细管内原位制备了聚合物整体固定相基质。
优化得到的最佳反应物组成为GMA：EDMA：正丙醇：1,4-丁二醇：水=0.32：0.08：0.35：0.2：0.05，在60℃反应24h,得到了孔径分布在100 ～300nm的大孔型整体固定相。
用亚胺基乙二酸对整体柱进行表面改性，制备了弱酸型阳离子交换整体固定相。
优化得到的最佳改性条件是：反应时间24h、温度75 °C和pH12.0。
本研究制备的一根仅5cm长的弱阳离子交换毛细管整体柱可以在13min内分离3种模型蛋白质（粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）。
关键词：毛细管整体柱，甲基丙烯酸酯，离子交换色谱，蛋白质1 前言毛细管整体柱具有制备简单、渗透性好、传质速度快、不用烧塞子和易于改性等优点，近年发展迅速，已在毛细管电色谱和微液相色谱领域得到了广泛应用[1, 2]。
大量研究证明多孔聚合物基质毛细管整体柱比多孔硅胶基质毛细管整体柱更适合生物大分子的分离[3～7]。
离子交换色谱是蛋白质等离子性生物大分子分离的首选色谱分离模式，但离子交换毛细管整体柱的制备及其用于蛋白质分离的研究还很少。
相比于强阳离子交换固定相，弱阳离子交换固定相与生物分子之间的相互作用比较温和，因而不易导致蛋白质变性。
Li等[8]制备了丙烯酰胺基质弱阳离子交换毛细管整体柱，Legido-Quigley等[9]开发了聚苯乙烯基质弱阳离子交换毛细管整体柱，均可用于蛋白质的分离。
但是，目前报道的弱阳离子交换整体柱通常采用两步法改性，即先用乙二胺处理，再用氯乙酸反应。
本研究利用亚胺乙二酸进行一步改性，简化了合成步骤，获得了具有羧酸基团的弱阳离子交换毛细管整体柱，并考察了其对蛋白的分离能力。
烯丙基_环糊精毛细管电色谱整体柱分离愈创甘油醚对映体_李英杰 (1)
(60∶40, v/v);运行电压 :17 kV;柱温 :20 ℃。 毛细 管前 处 理 方 式 :每 次 进 样 前 用 缓 冲 溶 液 平 衡 10 min。 5 流动相配比对分离度的影响
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图 5 愈创甘油醚的电色谱分离谱图 Fig5 Electrochromatographyspectrumofguaifenesin
图 3 柱温对分离度的影响 Fig3 Effectsofcolumntemperatureonresolution
8 运行电压对分离度的影响 图 4考察了运行电压对分离度的影响 。迁移时
本文在参考文献 [ 8, 9] 基 础上 , 改进了合成方 法 , 合成一种新型环糊精衍生物用于手性分离 。准 确称取 β -环糊精 6.81 g于 60 mL的二甲基甲酰胺 中 , 搅拌使其溶解 。 稍后加入干燥的氢氧化钠粉末 0.5 g, 室温下搅拌 2 h, 得黄色溶液 。 同时将 6 mL 的烯丙基溴缓慢滴入黄色溶液中 , 在氮气保护下持 续反应 48 h。将上述反应液过滤蒸干 , 将所得固体 溶解于少量无水甲醇中 , 然后滴加无水乙醚沉淀产 物 , 过滤后得到产品 。 真空干燥 24 h, 得到白色固体 为目标产物 。 3 整体柱的制备
参考文献 1 ZOUHan-fa(邹汉法 ), FUHong-jing(傅红靖 ), JINWen-hai (靳文海 ), etal.New advancesincapillaryelectrochromatography (毛细管电色谱研究的一些新 进展 ).ChemJChinUniv(高等学 校化学学报 ), 2004, 25(4):107 2 TianY, ZhongC, FuE, etal.Novelβ -cyclodextrinderivativefunctionalizedpolymethacrylate-basedmonolithiccolumnsforenantioselectiveseparationofibuprofenandnaproxenenantiomersincapillaryelectrochromatography.JChromatogrA, 2009, 1216(6):1000 3 YUPing(于平 ).Researchprogressinchiralcompounds(手性化合 物研究进展 ).ChemIndEngProg(化工进展 ), 2002, 21(9):635 4 KasaiHF, TsubukiM, TakahashiK, etal.Separationofstereoisomers ofseveralfuranderivativesbycapillarygaschromatography-mass spectrometry, supercriticalfluidchromatography, andliquidchromatographyusingchiralstationaryphases.JChromatogrA, 2002, 977 (1):125 5 ZHUChen-fu(主 沉浮 ), LIN Xiu-li(林秀 丽 ), WEIYun-he (魏 云 鹤 ).Capillaryelectrochromatographyanditsapplicationin chiralseparationofdrugs(毛细管电 色谱及其 在手性药 物分离中 的应用 ).ChinJBiochemPharm(中国生 化药物 杂志 ), 2003, 24 (4):204 6 LubdaD, CabreraK, NakanishiK, etal.Monolithicsilicacolumns withchemicallybondedβ -cyclodextrinasastationaryphaseforenantiomerseparationsofchiralpharmaceuticals.AnalBioanalChem, 2003, 377(5):892 7 NIU Yu-juan(牛 玉 娟 ).Determinationofguaifenesintabletsby HPLC(HPLC法测 定愈 创 甘油 醚片 的含 量 ).DrugStandChina (中国药品标准 ), 2008, 9(1):69 8 ZHAOSu-li(赵素 丽 ), LIJu-bai(李菊白 ).Thesynthesisand enantiomericseparationofpermethyl-allyl-β -cyclodextrinas stationaryphaseinGC(全甲基部分 烯丙基环 糊精作为 气相色谱 固定相的合成 和手性 拆分 ).Chem Reagents(化学 试剂 ), 2002, 24(3):131 9 ZhangQ, JiangZ, plexationofallylisothiocyanatewithβ cyclodextrinanditsderivativesandmolecularmicrocapsuleofallyl isothiocyanateinβ -cyclodextrin.EurFoodResTechnol, 2007, 225: 407 (本文于 2010年 6月 11 日收到 )
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胃蛋白酶亲和有机聚合物毛细管整体柱的制备及性能考察池翠杰;王伟;季一兵【摘要】The protein modified monolithic column in affinity capillary electrochromatography (CEC)has attracted considerable attention over the past decades because of its great enanti-oseparation ability. A porous polymethacrylate ester-based capillary monolithic column poly (glycidyl methacrylate-co-ethyleneglycol dimethacrylate )( poly( GMA-co-EDMA )) was pre-pared by in situ co-polymerization. The process was initiated thermally by azobisisobutyronitrile (AIBN). The polymerization mixture contained GMA as the function monomer and EDMA as the crosslinking agent with 1,4-butanediol and 1-propanol as the binary porogen solvent. Under the optimized reaction conditions,including the proportion of monomer and porogens,reaction temperature etc,the column exhibited a uniform structure,sufficient permeability and excel-lent pressure resistance. The separation of alkyl benzenes on the column was mainly based on typical reversed-phase chromatographic retention mechanism. The reproducibility and stability were good with RSDs less than 9. 0% . A pepsin functionalized organic polymer monolith was prepared by covalently bonded pepsin to poly(GMA-co-EDMA)monolith with glutaraldehyde as a spacer based on the activity of epoxide group. The enantioseparation performance of the pep-sin affinity monolith for basic enantiomers has been investigated by CEC. Nefopam,amlodip-ine,citalopram and chlorpheniramine were resolved,and baselineseparations of nefopam, amlodipine,citalopram were achieved. The influences of pH,operating voltage,temperature and sample quantity used on the chiral separation were studied. The chiral recognition mecha-nismof enantiomers on the monolithic column in CEC is discussed. This work developed a new method for the preparation and application of protein affinity monolith in CEC.%以热引发原位聚合方法制备了聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯（glycidyl methacrylate，GMA）-乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EDMA））毛细管整体柱，对整体柱的性能进行了表征。
结果表明，柱内部结构均匀、渗透性好；整体柱能够实现苯等中性小分子化合物的分离，具有反相色谱特征，重现性和稳定性良好。
利用整体柱环氧基团的活性，采用间接法，以戊二醛为连接臂制备胃蛋白酶亲和手性整体柱。
在毛细管电色谱模式下进行了柱分离性能研究，并对缓冲液 pH 值和运行电压等分离条件进行了考察。
结果表明，亲和整体柱对4种碱性手性药物（奈福泮、氨氯地平、西酞普兰、扑尔敏）有拆分效果，奈福泮、氨氯地平、西酞普兰能达到基线分离。
本文为蛋白质亲和毛细管电色谱整体柱的制备和应用提供了新的思路和方法。
【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】7页(P791-797)【关键词】毛细管电色谱;聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱;胃蛋白酶亲和手性整体柱;碱性药物;手性分离【作者】池翠杰;王伟;季一兵【作者单位】中国药科大学理学院，江苏南京 210009;中国药科大学理学院，江苏南京 210009;中国药科大学理学院，江苏南京 210009【正文语种】中文【中图分类】O658毛细管电色谱(CEC)具有毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)的双重分离性能［1］，被广泛用于手性药物、小分子物质、生物样品以及复杂混合物的分离分析［2-7］。
毛细管整体柱具有制备方法简单、化学性质稳定、传质效率高、柱容量高等优点，被誉为第4代分离介质［8］。
聚丙烯酸酯有机聚合物整体柱，因聚合单体选材范围广，可灵活在固定相中引入需要的活性基团，且使用的pH范围宽，在pH 2～12范围内能稳定存在，而成为目前研究最普遍的CEC 固定相基质之一［9］。
蛋白质类手性选择剂因独特的三维结构而对手性对映体有强大的拆分能力［10］。
限于蛋白质作添加剂时背景吸收会干扰分析测定［11］，因此其作为固定相的应用得到迅速发展［12-14］。
但是应用于整体柱CEC手性固定相中的报道目前仅限于牛血清白蛋白(BSA)和卵粘蛋白(OVM)［15，16］，且拆分的药物非常有限，只实现了色氨酸等氨基酸、华法林、安息香的分离，蛋白质亲和整体柱CEC手性拆分的优势没有得到充分发挥。
因此探寻拆分能力更强的蛋白质手性选择剂，以CEC整体柱为基质制备手性固定相(CSP)是目前较有前景的研究方向。
胃蛋白酶是一种酸性蛋白质，相对分子质量为34 600，等电点约为1，由327个氨基酸组成。
其作为手性选择剂适合拆分碱性和中性的手性对映体，具有广泛的应用范围，已成功应用于HPLC和CE对各类光学异构体的分离［17-19］。
Fanali等［17］将胃蛋白酶作为手性添加剂应用于毛细管区带电泳(CZE)实现了普萘洛尔、异丙嗪、维拉帕米等的拆分。
Haginaka等［18］将胃蛋白酶键合在硅胶颗粒上，制备填充HPLC柱，实现了苯二氮卓艹类、抗组胺类、β-阻断剂类等25种药物的拆分，充分体现了胃蛋白酶强大的手性拆分能力。
随后Haginaka等［19］又制备了胃蛋白酶和卵类粘蛋白混合手性HPLC固定相，对异丙基肾上腺素和阿普洛尔具有拆分效果。
而以整体柱为基质制备胃蛋白酶的CSP在CEC中的应用还未见报道。
将胃蛋白酶强大的拆分性能和整体柱的优势相结合会为亲和CEC的手性拆分提供新的思路。
本文合成了聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯(glycidyl methacrylate，GMA)-乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethyleneglycol dimethacrylate，EDMA))毛细管整体柱，探讨了聚合反应条件的影响，优化了基质柱的制备条件。
对合成的整体柱进行了性能考察，在加压毛细管电色谱模式下将其用于苯等小分子化合物的分离。
以聚(GMA-EDMA)整体柱为基质，戊二醛为连接臂制备了胃蛋白酶亲和整体柱，并应用于碱性药物的拆分，为有机聚合物整体柱对小分子物质以及蛋白质亲和CEC对手性药物的分离分析提供了方法。
1 实验部分1.1 仪器与试剂HP3DCE 7100毛细管电泳仪(美国Agilent公司)，S-3400NⅡ扫描电子显微镜(日本Hitachi公司);Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);ODGC-14B气相色谱柱温箱(日本Shimadzu公司);pHs-25型pH计(上海精密科学仪器有限公司);电子分析天平(美国 Sartorius公司);SWQ-IA智能数字恒温水浴锅(南京桑力电子设备厂)。
未涂层石英毛细管柱(75 μm I.D.，365 μm O.D.，河北永年光导纤维厂)。
GMA、EDMA、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)(纯度98%，美国 Sigma公司);正丙醇、1，4-丁二醇、戊二醛、氰基硼氢化钠(Aladdin公司);偶氮二异丁腈(AIBN)(上海第四试剂厂);胃蛋白酶(美国Sigma公司);奈福泮、氨氯地平、西酞普兰、扑尔敏均为消旋体;醋酸(HAc)、醋酸铵(NH4Ac)和其余试剂均为分析纯;实验用水为纯净水。
上述液体试剂在使用前用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，GMA和EDMA使用前用0.1 mol/L NaOH溶液处理以除去阻聚剂。
1.2 方法1.2.1 毛细管内壁的预处理毛细管内壁依次用1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液冲洗，然后用水冲洗干净，N2吹干。
将含50%(体积分数)γ-MAPS的甲醇溶液注入毛细管中，毛细管两端封口，于50℃水浴中反应12 h，然后将毛细管置于氮吹装置上，在0.2 MPa下用甲醇冲洗2 h，N2吹干，备用。
1.2.2 聚(GMA-EDMA)毛细管整体柱的制备毛细管整体柱反应液由活性单体GMA，交联剂EDMA，致孔剂体系1，4-丁二醇、正丙醇和引发剂AIBN组成。
GMA和EDMA的质量比为3∶2，GMA和EDMA质量之和占35%，正丙醇和1，4-丁二醇的质量比为3∶1，AIBN的质量分数为1.0%。
将反应液混匀，通氮气除氧，过滤，灌注于经前处理的毛细管(毛细管总长为35.0 cm，有效长度为25.0 cm)中，两端封口，于44℃水浴中反应12 h。