第23章细胞的大量培养
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(rollerbottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。
第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
【高中生物】动物细胞培养课件 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3
➢制成细胞悬液
1.将组织分散成单个细胞 ①方法: 机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理。 ②原因: 从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了 生长和增殖；能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
进行动物细胞培养地常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是 什么成分？用胃蛋白酶行吗？
这一阶段的细胞称为细胞株
增殖缓慢，甚至完全停止。
这一阶段的细胞称为细胞系
继续培养 （50代以后）
大部分细胞 衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性， 这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展。
遗传物质一定改变了
二、动物细胞培养的过程
➢流程图解
取动物组织
制成细胞悬液
用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶等 处理的方法，将组织分 散成单个细胞
放入CO2培养箱中培养 转入培养液进行原代培养
传代培养
放入CO2 培养箱中培养
有关动物细胞培养的问题
➢酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？ 不对；使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能
分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成 损伤。
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞相比，分化程度低的与分化程度高的 细胞相比，哪些细胞更易于培养？为什么？
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
➢胚胎干细胞（简称ES细胞）
分布: 存在于早期胚胎中 举例: ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞
和造血干细胞等 特点: 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的
细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官 甚至个体的潜能。
CHO细胞大规培养
摘要CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。
微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。
由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。
载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。
后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。
首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。
其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。
最后将种子细胞进行大规模培养。
运用半连续式培养来操作：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
最后在细胞培养过程中进行细胞常数的检查和培养基内污染物的检测一些抗凋亡策略来增加细胞培养的效率。
[关键字]CHO细胞;明胶微载体;无血清培养;半连续式培养目录摘要 (1)关键字：CHO细胞明胶微载体无血清培养半连续式培养 (1)绪论 (3)1.2CHO细胞培养的特性 (3)2.2.1培养基的物理性质 (5)2.2.2无血清培养 (7)3.1.2蛋白质作基质的微载体 (8)3.1.3微载体培养原理与操作 (9)3.2.2微载体培养种子细胞 (12)3.2.3微载体培养的细胞传代 (12)3.3半连续式培养（semi-continuous culture）操作 (12)4.2细胞常数检查 (14)4.3CHO细胞培养内污染物的检测 (14)4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 (15)4.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测 (16)5抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用 (16)5.1 营养物质抗凋亡 (17)5.2 基因抗凋亡 (17)5.3 化学方法抗凋亡 (17)参考文献： (18)绪论1.1引言CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
培养细胞的细胞生物学(体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生
培养细胞的细胞生物学（体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。
且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。
细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。
恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
大规模培养细胞技术
[9]张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺[J].华东理工大学学报,1998,24:659~663
[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus[J].App Biochem Biotechnol,1997,62:291~30
2.1.3
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
大规模
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
高考生物三轮复习回归教材 ：选择性必修3之细胞工程
高考生物三轮复习回归教材：选择性必修3之细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
植物细胞工程：植物组织培养、植物体细胞杂交动物细胞工程：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植第1节植物细胞工程一、植物组织培养（一）原理1、细胞的全能性：①定义：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。
②在植物体内，细胞只能表现出分化现象，不能表现出全能性。
③细胞分化的根本原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
④细胞表现出全能性的根本原因：细胞中含有一种生物的全部遗传物质。
2、植物激素的调节植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。
（二）过程1、植物组织培养的一般的过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化（失去其特有的结构和功能、转变成未分化的细胞的过程）再分化（先诱导生芽；再诱导生根）试管苗移栽植株2、菊花的组织培养过程菊花的幼茎段（外植体）：消毒（①流水冲洗②酒精消毒（30s）③无菌水冲洗④次氯酸钠溶液（30min）⑤无菌水冲洗）、切段、接种（不要倒插，形态学上端在上）、封瓶口脱分化（脱分化培养基；18~22℃；避光）再分化（先诱导生芽；再诱导生根）；每日适当时间和强度的光照植株二、植物体细胞杂交（一）原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性（二）过程制备原生质体（纤维素酶和果胶酶）、诱导原生质体融合（物理法：电融合法、离心法；化学法：聚乙二醇（PEG）融合法高Ca2+-高pH融合法）、再生出细胞壁、把杂种细胞培育成杂种植物、选择与移栽（三）意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种三、植物细胞工程的应用（一）植物繁殖的新途径1、快速繁殖：又叫微型繁殖技术。
大规模细胞培养技术的操作方式
大规模细胞培养技术的操作方式规模细胞培养的操作方式可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种。
一、分批式培养（batch culture）分批式培养（batch culture）是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；直观反映细胞生长代谢的过程。
因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；可直接放大。
由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。
分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。
分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。
收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
二、流加式培养（feeding culture）1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
西洋参细胞大量培养的工艺学研究
西洋参细胞大量培养的工艺学研究
周立刚;郑光植
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1991(007)003
【摘要】较适合于植物细胞悬浮培养的培养液体积为三角瓶总容量的1/5至2/5。
氧溶浓度的输出随着温度的增加而增加。
西洋参细胞培养液的粘性明显大于无细胞培养液。
细胞发酵培养较合适的搅拌速度为60rpm。
渗透压的增大会明显地提高
细胞培养物的皂甙含量,但对细胞的生长不利。
本研究为今后设计出适合于西洋参
细胞大量培养的发酵罐提供了重要的依据。
【总页数】5页(P230-234)
【作者】周立刚;郑光植
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S188
【相关文献】
1.西洋参细胞大量培养的研究 [J], 周立刚;郑光植
2.西洋参细胞培养物与进口西洋参有效成份比较研究 [J], 袁丽红;欧阳平凯
3.植物细胞大量培养的工艺学 [J], 周立刚;郑光植
4.大量培养表皮细胞方法的研究 [J], 苏波;张素贞
5.大量培养诱导乳腺癌患者自体DC和CIK细胞的研究 [J], 王先明;何劲松;陈伟财;王敏;闵军;邵静
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• 3、中空纤维培养法：模拟脉管在细胞间 分布扩散的原理，采用合成的中空纤维 制成类似脉管分布扩散系统。细胞接种 于中空纤维外表面与反应器内表面之间 ，培养液自入口处穿过滤膜与细胞接触 ，并可在出口进入储罐，进行再生处理 ，循环使用。如图23-8
中空纤维灌注反应器
• 4 、 玻 璃 珠 床 反 应 器 （ 如 图 23-9 ） ： 3mm直径的硅硼玻璃珠 使细胞贴附在其 表面，细胞在灌注的培养基中生长。 • 5、包被(埋)细胞培养法：用白明胶、多 聚赖氨酸、藻酸盐、琼脂糖材料等制成 有孔微载体，细胞包被(或包埋) 孔内， 在贯注的培养基中生长，常用有孔微载 体。
• 5、培养系统的控制 • (1) pH调控系统：PH探头 PH显示 调空 板 滴加酸碱；5%CO2/95%O2 的比例来调节 pH ；加入Hepes。 • （ 2 ） 通 气 调 控 系 统 ： Roux瓶 静 置 培 养 （ 10:1）溶解氧 （表23-1 ）；在40L生物反应 器试验中 扩散+灌注培养可获得高密度细胞（ 如表3-2） • （3）通过测定氧化还原势能（ORP），可监 控 细胞生长动态及对数生长期（如图23-2）
• ③无泡搅拌反应器：反应器中装有多孔的疏水 性的塑料管，装配成通气搅拌桨。由于选用多 孔塑料管具有良好的氧通透性，从而实现无泡 通气搅拌。 • ④其它细胞培养生物反应器
– 1）流化床生物反应器：基本原理就是用胶原包被 的像海绵一样的多孔性微粒填充反应塔，细胞在微 粒孔内，培养基在反应塔上方并向下流动，呈流态 化，即可不断提供细胞必要的营养成分，而培养产 物或代谢产物又不断被排除。
• ①气升式细胞培养生物反应器：主要有 两种构型，一种是内循环式，另一种是 外循环式。（图23-10）混合物从罐底部 的喷射管进入反映器的中央导流管使中 央溶液密度低于外部区域，从而形成循 环，既可起混合作用，又可通气，其生 产流程如图23-11
10ห้องสมุดไป่ตู้0L动物细胞培养流程图
• ② 通气搅拌生物反应器 • 1）笼式通气搅拌生物反应器（如图2316）：通气/调PH都在笼内进行，产生的 气泡由400目的不锈钢丝网阻断，不会因 气泡破裂产生剪切力，直接损伤细胞， 气孔由多孔分布器发散，以满足细胞对 溶氧的需求。
多层培养装置
• （3）多层托盘式装置 ：将多层繁殖器 中的细胞贴附的平板，改换成彼此独立 的类似于大平皿样的托盘(如图23-4C/D ）。 • （4）opticell培养系统 :系统包括一个 圆柱形陶制外壳，内装有许多1平方mm的 四方管道，提供了一个大的表面积 ,支 持细胞贴附
• （5）塑料软片培养系统:用高分子聚合 物制成透气、无毒性软片或塑料袋，在 软片表面或袋内壁支持细胞贴附生长（ 图23-1） • （6）Heli-Cel(Sterilin)薄膜卷带式培养 ：采用聚苯乙烯制成的螺旋形多孔薄膜 带，呈螺旋状管道或缠卷状管道，在卷 膜上支持细胞贴附生长（图23-1）
表23-2 40L生物反应器加氧方法(30L工作体积，外观比例1.5:1)
维持细胞数 加氧方法 (106/mL) 空气（10mg/L/min，在40r/min） (1)表面通气 (2)直接扩散 (3)旋转过滤扩散 (4)灌注（1体积/小时） (5) (4)+(3) 旋转过滤扩散 (3)+(4) 0.5 4.6 3.0 12.6 15.9 51.0 92.0 0.08 0.76 0.40 2.10 2.65 8.50 15.00
第23章 细胞的大量培养
• 因实验室采用的细胞培养技术获得的细 胞量有限，不能满足生产的需求，必须 改用超产培养技术方可获得大量细胞， 目前这种技术种类繁多，归纳起来有三 大类：(1)单层静置贴壁培养法；(2)悬浮 培养法；(3)固定化培养法。
• 一、单层静置贴壁培养法：转管及转瓶培养和 旋转园柱管培养 • 二、悬浮培养法： （1）翻滚培养 （2）旋转 培养 （3）电磁搅拌培养（4）振荡培养 （5 ）振动器培养 （6）滋养器装置（7）发酵罐 培养 （包括搅拌生物反应器和气动发酵器 培 养） • 三、固定化培养法： （一）多层培养： 1.多 层繁殖器；2.多层托盘式装置；3.Opticell培 养系统；4.塑料软片培养系统；5.Heli-cel薄 膜卷带式培养 （二）微载体培养 （三）中 空纤维灌注培养 （四）玻璃珠床培养 （五） 包被细胞培养(如图)
Spier 于 19 84 年 设 计 的 笼 式 搅 拌 器
• 改进后的CelliGen笼式通气搅拌器（如 图23-17、18所示） 增设有通气腔和笼 式的消泡腔，气液交换在由200目（ 75μm）不锈钢丝网制成的通气腔内实 现，通气过程中所产生的泡沫，经管道 进入消泡腔中的200目丝网时被破碎，分 散成气、液两部分，这样既避免在培养 基中产生泡沫而损伤细胞，又可使通气 中产生的泡沫及时消散防止细胞呼吸窒 息。
生 产 用
CF-IMMOTM 流 化 床 反 应 器
– 2）陶质矩形通道蜂窝状生物反应器：反应 器构型是在一圆筒内装有一只有许多陶质矩 形通道的蜂窝状圆柱体。既可用于培养悬浮 生长的细胞，又可用于培养贴壁依赖性细胞 ，放大时可采用增加套数。 – 3）细胞的剪切敏感性与生物反应器设计： 剪切力往往由于搅拌和气泡破碎而产生可直 接损伤细胞，可采取以下措施：1、加入适 量血清保护细胞膜2、加入保护剂和消泡剂 3、采用多孔通气搅拌器，实现无泡通气
• 2、微载体细胞培养法（如图23-5） • 细胞贴附在载体上，载体携带细胞在容器中 呈悬浮状进行大量培养。（具体培养方法参 考P234~237） • 各种载体的选择和处理方法（参见 P238~246） • 见图23-6和图23-7
微载体培养装置结构图
一种容易换液的简单载体培养系统
一种应用于高密度微载体培养细胞的灌注系统
• 4、培养基和营养物质的选择 • 常用Eagle(BME或MEM)加2～5%小牛血 清，但谷氨酰胺需不断补充，同时可补 充胱氨酸、精氨酸，胰岛素（5mg/L） 、 转 铁 蛋 白 （ 5 ～ 35mg/L ） 、 胆 胺 （ 20μmol/L）及硒（5μg/L）等,Ca++ 、Mg++应尽量降低，以防细胞结团、贴 壁、下沉，也可采用补加胰蛋白酶（ 2mg/L）可以克服。
• 2、悬浮培养基中的添加剂 • 保护剂：羟甲基纤维钠(纤维素) ；消泡剂：硅 油/pluronic F • 3、培养条件：（1）温度 适宜温度为37℃， 通常选择36℃±0.5 （2）pH 理想的pH值为 7.2（3）细胞生长期的选择 应选择对数生长 期的细胞接种培养 （4）接种细胞密度 ：指导 浓度为5×104 ～2×105 细胞/mL或5×103 ～ 2×104细胞/mL。（5）搅拌速度 ：可用100 ～500r/min，通常为200~350r/min，微载 体培养在20~100r/min
• 2、悬浮培养的方法：（1） 静置悬浮 培养法 （2 ） 翻滚（翻沟）培养法 （ 3） 旋转（转鼓）培养法 （4） 旋摇（ 摇瓶/摇床）培养法 （5）电磁悬搅培养 法 （6）振荡培养法 （7）振动器培养 法 （8）滋养器装置 (9) 发酵罐培养( 动物细胞培养生物反应器) • 其中发酵罐培养有很大的发展，有多种 生物反映器，如：
表23-1 Roux培养瓶气相和液相氧的浓度 在900ML空瓶中的氧 在100ML培养液中的氧
900×0.21×32/22400=0.27g 100×7.6×10-4=0.0076g
注：0.21为氧在空氧中的比例 32=氧的分子量 22400为克分子数,7.6×10-4为氧与空气平衡时37℃ 水中氧的溶解度。
CelliGen
笼 式 通 气 搅 拌 器
GelliGen细胞培养罐
• 2）双层笼式通气搅拌器生物反应器（ Cellcul-20） • 为了克服CelliGen罐的缺点{ 1)气路系统不能 就地灭菌 2)氧传递系数小 3)笼式通气搅拌器 结构复杂，拆卸清洗困难。}而改进，研制了 20L双层笼式通气搅拌器生物反应器 [1)改变 气路系统2）增设蒸汽灭菌管道，使能就地灭 菌。3)采用磁力驱动装置，使结构简化。 4)将 单层笼式通气搅拌器改为双层笼式通气搅拌器 ，以扩大丝网交换面积，使氧传递系数提高。 5)改进罐体拆卸装置和附属配件等。]
氧的分送(mg/L/h)
氧（10mg/min，在80 r/min ）
假定氧利用率为2～6μg/106细胞/h
图23-2 与细胞生长和葡萄糖利用相关的ORP的变化(6) ORP最小值出现在对数生长末期(A)前24小时
第二节 细胞大量培养的类型和 方法
• 一、 大规模培养系统的类型 • (1) 批量换液(2) 半连续批量培养系统(3)用 连续灌注法 (4)连续-流动培养系统（如图 23-3） • 二、大规模生产细胞的方法 • (一)单层静置贴壁培养法：1、 Roux瓶 / 方瓶 2、转管及转瓶培养 3、旋转圆柱管 培养
连续-流动培养系统
• (二)固定化培养法：将细胞限制或定位于特定 空间位置的培养技术称为细胞固定化培养。 • 1、多层培养法 • （1） 多层繁殖器在玻璃园筒中：（大方 缸）有多层玻璃隔板支持细胞贴附生长（如 图23-4A） • （2）钛碟装置 多层圆柱状不锈钢(带有观 察条件)罐内或玻璃瓶内装入钛碟圆盘支持细 胞贴附生长。可改变位置和旋转（图23-4B）
第一节 培养要素控制及其参数的 测定
一、细胞的定量测定 (一)细胞数量的测定： 结晶紫或台盼兰染色法 (二)细胞活性的测定 1、直接测定：台盼兰染色法测计存活率MTT 法或 3H-TdR掺入法可显示细胞的代谢状态和 生长繁殖的活力。 • 2、间接测定：（1）葡萄糖的利用（2）乳酸 或丙酮酸代谢产物量 • • • •
悬浮培养的优点：
• (1)可连续扩大生产量。 • (2)有利于细胞与培基中的营养物质和气体充分接触， 而且易于控制培养条件(温度、pH、氧分压和CO2 等) 。 • (3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究。 • (4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和 污染的机会。 • (5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持 续维持在对数生长期。 • (6)悬浮适应的原贴壁癌细胞仍能附壁生长。 • (7)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物