BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答
家蚕生长阻遏肽结合蛋白与杆状病毒P13蛋白互作关系的研究
家蚕生长阻遏肽结合蛋白与杆状病毒P13蛋白互作关系的研究邓培渊;王国霞;王辉;李玉华;李长看【摘要】为探明生长阻遏肽结合蛋白(Growth blocking peptide binding protein,GBPBP)与杆状病毒P13蛋白的互作关系,以家蚕Bombyx mori Linnaeus 为供试昆虫,采用GST pull-down试验的方法,检测了家蚕生长阻遏肽结合蛋白(BmGBPBP)与黏虫核型多角体病毒P13蛋白(LsP13)间的相互作用.结果表明,GBPBP蛋白与P13蛋白发生了结合反应,暗示两者生理功能之间具有一定的联系.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2015(049)005【总页数】5页(P641-645)【关键词】家蚕;GBPBP;LsGBPBP;P13蛋白【作者】邓培渊;王国霞;王辉;李玉华;李长看【作者单位】郑州师范学院,河南郑州450044;郑州师范学院,河南郑州450044;河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;郑州师范学院,河南郑州450044;郑州师范学院,河南郑州450044【正文语种】中文【中图分类】Q966核型多角体病毒(Nucleopolyhedro viruses，NPVs)是一类广泛用于害虫生物防治的杆状病毒。
根据其分子亲缘关系和是否含有包膜糖蛋白GP64，分为I型和 II型2个组［1］。
其中鳞翅目昆虫的核型多角体病毒属于II型杆状病毒，在这类病毒的基因组中普遍存在一种P13基因［2-5］，不仅在病毒侵染昆虫细胞的过程中持续表达，而且对下游基因的表达也有负调控作用［6］。
研究还发现，P13蛋白是一类与病毒杀虫活性相关的蛋白，但对其杀虫作用的分子机理尚不明确［7］。
生长阻遏肽(Growth blocking peptide，GBP)是存在于昆虫血淋巴中的一类多肽，已从黏虫Mythimna(Leucania)separata、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae和斜纹夜蛾Spodoptera litura等多种鳞翅目昆虫中分离鉴定出来［8-11］。
感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析
感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析摘要：家蚕 (Bombyx mori) 是重要的经济昆虫，然而，它常常受到家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的侵袭。
为了抵御病毒入侵，家蚕免疫系统会调控一系列与抗病毒相关的基因。
本研究采用高通量测序技术，对BmNPV感染与非感染家蚕的转录组进行了比较，以揭示家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能。
引言：家蚕是一种重要的经济昆虫，广泛应用于丝绸和蚕茧的生产。
然而，病毒感染严重影响了家蚕的产量和质量。
BmNPV是最常见的家蚕病毒之一，能够引起严重的病害。
为了抵御病毒入侵，家蚕免疫系统通过调控抗病毒相关基因的表达来增强自身的抵抗力。
本研究旨在通过分析感染BmNPV与非感染家蚕的转录组差异，揭示家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能。
方法：本研究选取BmNPV感染和非感染家蚕的肝胰腺组织作为样品，进行了转录组测序。
首先，提取样品总RNA并进行纯化。
然后，利用逆转录酶将RNA转换为cDNA，接着使用Illumina HiSeq 2500平台进行二代测序。
得到的测序数据经过质控和过滤，最后进行了比对和基因差异表达分析。
结果：通过转录组测序和分析，我们共找到了xxx个差异表达基因（DEGs）。
进一步分析显示，这些差异表达基因主要涉及免疫调节、抗病毒反应和信号转导等生物学过程。
其中，一些基因的表达在感染BmNPV时上调，而另一些基因则下调。
这些差异表达基因包括关键的免疫相关基因，如Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）、抗菌肽和免疫信号转导分子。
进一步的功能富集分析显示，感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因主要涉及信号转导途径、炎症反应和免疫反应调节等功能。
这些结果揭示了感染BmNPV时家蚕免疫系统受到激活，并通过调控基因表达来抵御病毒入侵。
BmNPV_侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析
引用格式：刘 勇，龚椿营，艾均文，等. BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析[J]. 湖南农业科学，2023（11）：1-9，13. DOI:DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.011.001蚕桑文化是中国文明的起点，至少已有4 000 a 以上的历史。
家蚕作为重要的经济昆虫对人类文化、经济发展贡献巨大。
种桑养蚕至今仍是部分地区农民的重要收入来源。
然而生产上，家蚕始终受到细菌病、病毒病等的侵害，给农户造成一定的经济损失[1]。
其中，以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）引起的血液型脓病对蚕桑产业的威胁最大，其传染性极强，一旦发病就难以控制[2]。
目前，环境消毒仍是预防蚕桑病害的主要措施，但该防治方法费时费力，严重制约了蚕桑业的发展。
在此背景下，学者们通过传统杂交育种、分子标记育种和转基因育种等方式选育抗性品种来预防家蚕频发性血液型脓病，虽然这种方式前期投入大、开发周期长，但是一旦成功选育出抗性品种，其经济效益、社会效益和生态效益都是不可估量的[3]。
因此，基于材料间所存在的抗性差异而进行家蚕抗病基因筛选、抗病机制解析成为近年来蚕桑领域的热门课题。
BmNPV是一种环状双链DNA的核型多角体病毒，具有包涵体衍生病毒（occlusion-derived virus，ODV）和出芽型病毒（budded virus，BV）2种不同形式，侵染家蚕的方式包括ODV引起的食下感染和BV引起的创伤感染[3]。
BmNPV在家蚕体内复制增BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析刘 勇，龚椿营，艾均文，薛 宏，何行健，贾超华，陈卓华，任立志（湖南省蚕桑科学研究所，湖南长沙 410127）摘 要：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是造成蚕业严重经济损失的主要病原体之一，主要通过食下感染引发家蚕血液型脓病，中肠是免疫病原体的重要组织器官。
《家蚕遗传育种学》习题库(含答案)
《家蚕遗传育种学》习题集第一部分习题绪论1、简述家蚕遗传学和育种学的关系。
2、过去的一个世纪里，家蚕遗传育种学经历了哪几个主要发展阶段？目前的主要发展特点为何？3、近代家蚕品种研究有何特点？4、二十一世纪家蚕品种研究可能有哪些方向？第一章形态性状的遗传1、名词解释（1）p群基因（2）E群基因（3）黄体色（4）龙角（5）虎斑（6）褐圆斑（7）狭胸（8）螯虾蛹2、简答（1）等位基因和相似性状非等位基因的命名有何区别？（2）家蚕卵形态性状主要包括哪几个部分？各自的遗传规律怎样？（3）家蚕白色卵类、褐色卵类、灰色卵类的主要种类及其遗传特点为何？（4）田中和蒋同庆关于家蚕基楚斑纹、附加斑纹的划分有何不同？（5）油蚕成因为何？有哪些主要种类？（6）黄血基因与黄红茧系茧色有何关系？（7）显性白茧的实质是怎样的？3、分析比较题（1）已知家蚕第2白卵（w-2）对与其独立遗传的红色卵（re）基因表现上位作用，请图示w-2与re杂交的F1、F2基因型、表型、分离比。
（2）图示家蚕互补绿茧（Ca/Ga Gb/Gb）与纯合白茧（+/+ +/+）杂交后代的分离情形。
4、叙述题叙述家蚕赤蚁性状突变基因的种类、特征、遗传特点及相互关系。
第二章连锁遗传1、名词解释（1）基因分析（2）相引/相斥（3）基因定位（4）连锁遗传图2、简答什么是家蚕连锁遗传的最大特点？在基因分析中有何利用？3、分析题已知家蚕幼虫虎斑（Ze）基因和黄体色（lem）基因均属于第3连锁群，现选择一个既是虎斑又是黄体色的系统与正常型（非虎斑和正常体色）系统杂交，请写出其亲本（P）、F1、F2世代的基因型、表型与F2的分离比。
4、分析计算题已通过连续分析探明，家蚕隐性灰卵（gr-r）基因属于第2连锁群。
隐性灰卵系统为姬蚕（p）、白血（+Y），通过与暗色斑（P M）黄血（Y）系统杂交进行基因定位，F1雄与该隐性灰卵雌测定，其性状分离调查结果如下表（其中基因符号代表表型）：（gr-r++）♀× [（gr-r++）×(+P M Y)]F1♂性状分离情况表现型个体数gr-r p + 1084+ P M Y 1019+ P Y 111gr-r P M+ 102gr-r P Y 310+ P M+ 286+ P + 3gr-r P M Y 1（1）写出两亲本的基因型；（2）确定gr-r、P M、Y三基因的直线顺序；（3）计算出双交换值和三基因两两间的单交换值；（4）绘出三基因的连锁图。
家蚕BiP基因的克隆及其对家蚕核型多角体病毒感染的影响
家蚕BiP基因的克隆及其对家蚕核型多角体病毒感染的影响樊峰秀;李陈亚;Charles Amanze;郝碧芳
【期刊名称】《江苏科技大学学报:自然科学版》
【年(卷),期】2022(36)1
【摘要】结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP)是一种分子伴侣蛋白,可促进蛋白正确折叠,并可能在病毒感染过程中发挥重要作用.从家蚕卵巢细胞中扩增了BiP基因,该基因全长为1977 nt;家蚕和其他6种昆虫多序列比对显示BiP在物种进化过程中保守性较强,家蚕与小菜蛾、黑脉金斑蝶BiP同源性最高,为94.97%;进化分析也显示与小菜蛾的亲缘关系最近.免疫印迹检测显示BiP在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染的细胞中表达上调.当利用siRNA敲低家蚕细胞中BiP表达后,BmNPV的感染效率显著降低.本研究结果为深入解析BiP基因在BmNPV感染家蚕过程中所发挥的作用提供参考.【总页数】6页(P110-115)
【作者】樊峰秀;李陈亚;Charles Amanze;郝碧芳
【作者单位】江苏科技大学生物技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
【相关文献】
1.广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因r克隆与序列分析
2.家蚕核型多角体病毒orf25基因在病毒感染过程中编码一个30kDa的晚期蛋白
3.家蚕3-羟酰辅酶A脱
氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达4.家蚕核型多角体病毒四方形多角体突变株多角体蛋白基因的DNA序列分析5.家蚕核型多角体病毒对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的影响
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BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的中肠蛋白质组变化分析
蚕桑通报 2009 年 第 40 卷 第 1 期
图1 P50和306家蚕品种5龄中肠蛋白质双向电泳图谱 Fig. 1 Midgut 2D-PAGE protein profiles of silkworm breed P50 aiculture
第40卷 第1期 2009年2月 Vol.40 No.1 Feb., 2009
BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的 中肠蛋白质组变化分析
兰天云 1，2， 陈金娥 2， 张金卫 3， 杨惠娟 2， 李建营 2， 丁 农 3， 钟伯雄 2， 段家龙 1 （1. 安徽农业大学 生命科学学院， 安徽 合肥 230036； 2. 浙江大学 动物科学学院， 浙江 杭州 310029；
(1. College of Life Science, Anhui Agriculture University, Hefei 230036, China; 2. College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 3. Huzhou Academy of Agriculture Sciences, Huzhou 313000, China)
Abstract: To understand the proteome changes of silkworm midgut after infected by BmNPV as well as to find out the anti -BmNPV related genes, antivirus experiments were carried out in the nine different silkworm breeds. Results found an antivirus silkworm breed P50 and a susceptible breed 306 and they had a great difference in the antivirus ability. The antivirus ability in the anti-BmNPV individuals of P50 were 72 centesimal points higher than that of the 306. The midgut protein expression profiles of the P50 and 306 on the first (1st) day and the fourth (4th) day of fifth instar after oral infected by BmNPV were analyzed by 2-dmension eletrophoresis. The results showed that the first day of the fifth instar after the infection 10 specific protein spots were found in both P50 and 306 breed, respectively. There were 33 specific protein spots on the fourth day were found in 306 while 14 were found on that of P50 and these proteins were different in the characters. These proteins may be involved in the antivirus ability to BmNPV in the anti-breed and the susceptibility to BmNPV in the susceptible breed. Keywords: Bombyx mori; BmNPV; Midgut; Proteomics
BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响
BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响唐芬芬; 杨伟克; 朱峰; 邵榆岚; 张永红; 白兴荣【期刊名称】《《南方农业学报》》【年(卷),期】2019(050)010【总页数】6页(P2308-2313)【关键词】家蚕; 家蚕核型多角体病毒(BmNPV); SOD; CAT; 酶活性; 基因表达【作者】唐芬芬; 杨伟克; 朱峰; 邵榆岚; 张永红; 白兴荣【作者单位】云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自 661101【正文语种】中文【中图分类】S884.510 引言【研究意义】家蚕是一种重要的经济昆虫，同时是鳞翅目昆虫的模式生物，加之遗传背景清晰且饲育简单，已发展成为研究宿主—病原互作机制的理想材料（Geng et al.，2016a，2016b）。
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）在维持生物体内自由基代谢平衡的过程中发挥重要作用，在一定程度上能反映生物的抗逆能力（Lesser，2006；方允中和郑荣梁，2008）。
因此，研究抗氧化酶活性及其基因表达在家蚕抵抗病原微生物侵染过程中的变化规律，尤其是明确其在家蚕抵抗家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）时的功能和作用，可为揭示BmNPV侵染及其致病机理提供理论依据。
【前人研究进展】BmNPV感染主要引发家蚕血液型脓病，传染性强，危害严重，每年给桑蚕产业带来巨大经济损失（邵榆岚等，2017）。
据家蚕流行病学调查发现，BmNPV是云南蚕区发生较广且危害严重的主要病原（白兴荣等，2010），生产上多在三龄蚕后感染发病，且一旦发病即迅速蔓延。
虽然关于家蚕抵抗病毒的研究已有大量报道，但抗病机制至今尚未完全明确。
昆虫遭受外源病原菌侵染时，其机体内正常的代谢平衡被打破，诱发活性氧（ROS）过度积累，进而损伤宿主细胞（Kumar et al.，2003）。
家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展
家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)005【摘要】追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义.文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性；再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能.另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因—蛋白、蛋白—蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料.【总页数】5页(P854-858)【作者】覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐【作者单位】广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】S884.51【相关文献】1.对构建的家蚕抗核型多角体病毒病近等基因系的评估 [J], 刘晓勇;姚勤;陈克平2.家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展 [J], 覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐;3.短时热激后家蚕对核型多角体病毒的抗性及相关抗菌肽和热激蛋白基因表达水平的变化 [J], 唐芬芬;郑亚强;白兴荣;陈斌4.家蚕核型多角体病毒orf25基因在病毒感染过程中编码一个30kDa的晚期蛋白[J], 王海燕;陈克平;郭忠建;姚勤5.家蚕抗核型多角体病毒病研究进展 [J], 邢东旭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV
的感染应答
家蚕浓核病毒(Bm BDV)能特异性地侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,是家蚕软化病的病原。
Bm BDV的基因组由两种不同的单链DNA,VD1(6,543 nts)和
VD2(6,022 nts)构成,病毒粒子中只含有两种DNA分子中的一种。
目前还没有一种细胞系可感染Bm BDV,也不能通过基因操作改变Bm BDV的基因研究病毒基因的功能。
家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)基因组由10个分节ds RNA片段组成,每个ds RNA片段含有一个完整的开放阅读框(ORF)。
由于Bm CPV为ds RNA,且缺乏Bm CPV的敏感细胞系,无法通过基因敲除或敲入研究Bm CPV基因功能,导致Bm CPV基因功能研究几无进展。
不同的家蚕品种对Bm CPV的抗性存在差异,但品种间的抗性差异机制仍有许多不明之处。
基于目前的研究现状和存在问题,我们开展了基于Bm BDV基因组DNA质粒拯救病毒研究、基于体外转录的病毒RNA转染细胞拯救Bm CPV研究,期望为Bm BDV 和Bm CPV基因的功能研究提供新的系统;同时,利用RNA-Seq技术,研究了不同抗性品种家蚕感染Bm CPV后,中肠组织基因组转录水平的变化,期望为理解家蚕对Bm CPV的感染应答及抗Bm CPV的分子机制提供新的线索。
1、Bm BDV反向遗传学系统的研究为了提供Bm BDV基因功能的研究平台,将含有Bm BDV VD1基因组的重组质粒p GEM-VD1转染家蚕卵巢(Bm N)细胞,发现细胞表现出明显的细胞病变;Western blotting与免疫荧光皆能检测到Bm BDV基因的表达。
同时,我们通过Bac-to-Bac载体表达系统构建了装载VD1全基因组的重组杆状病毒Bm Bac-VD1,该重组病毒基因组DNA转染Bm N培养细胞,可观察到细胞出现明显病变,将培养上清转接正常Bm N细胞,表现出相同的病变;Western
blotting与免疫荧光试验可检测到Bm BDV病毒结构蛋白的表达;透射电镜可同时观察到球形病毒粒子与杆状病毒粒子,通过差速离心将两种病毒粒子分离,分子生物学鉴定结果显示,球形病毒样颗粒中包裹有重组病毒基因组。
上述结果显示,通过基于病毒基因组的质粒DNA可以拯救出Bm BDV,通过杆状病毒装载VD1全基因组可获得Bm BDV样的病毒颗粒,表明我们已建立了Bm BDV的反向遗传学系统,为通过基因缺失或突变的方式研究Bm BDV的基因功能提供了平台。
2、Bm CPV反向遗传学系统的研究利用片段搭桥和同源重组等方法对Bm CPV 基因组10个分节ds RNA片段的全长c DNA进行了克隆,并用T7启动子分别控制10个分节ds RNA片段的全长c DNA,克隆进p IZT-V5/His载体,获得了重组质粒p IZT-CS1—p IZT-CS10。
同时,用Ds Red基因替换Bm CPV S10片段c DNA中的多角体蛋白基因的开放读码框(ORF),构建了重组质粒p IZT-CS10(Ds Red)。
以线性化的p IZT-CS1—p IZT-CS10为模板,体外转录成Bm CPV10个基因组片段的RNA,转染家蚕培养细胞,发现转染细胞表现出发病症状;Western blotting和免疫荧光能够检测到Bm CPV基因的表达蛋白;Real-time PCR结果显示,转染细胞中Bm CPV基因的明显上升,说明体外转录的病毒基因组片段的RNA 转染家蚕培养细胞可拯救出具有复制能力Bm CPV;进而,将Bm CPV S1-S9片段的体外转录RNA与p IZT-CS10(Ds Red)为模板的体外转录RNA共转染家蚕Bm N细胞,6天后将转染细胞的培养上清转接正常细胞,转接细胞发出红色荧光,随着培养时间的延长,荧光细胞的比例逐渐增大,说明S10片段为Bm CPV复制必须片段,病毒衣壳蛋白识别包埋S10片段的位点位于非编码区。
上述结果表明,通过建立的基于体外转录的病毒基因组片段的RNA转染家蚕培养细胞拯救Bm CPV系统可以用于研究Bm CPV的基因功能,可通过将外源基因导入Bm CPV基因组的复制非
必须片段构建重组Bm CPV表达外源基因或通过类似策略研发重组CPV生物杀虫剂。
3、不同抗性家蚕品种感染家蚕质型多角体病毒的中肠组织比较转录组学研究为了探讨品种间Bm CPV的抗性产生机制,我们通过RNA-Seq测序技术,比较分析了家蚕蓝5(Lan5,Bm CPV易感品种)和欧17(Ou17,Bm CPV抗性品种)感染家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)后中肠组织的基因表达谱。
测序结果显示,在感染的Lan5、Ou17中肠组织中,上调表达基因数量分别为330和218个,而下调表达基因数量分别为147和260个。
我们对Lan5与Ou17中肠组织差异表达基因(DEGs)进行了GO(Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)富集分析,并利用STRING数据库分析了Lan5与Ou17中肠组织共同上调/下调基因的相互作用。
结果显示,部分共同差异表达基因相互作用并形成网络,在共同上调表达基因中,表皮蛋白Cpr62Bc和微型染色体维持蛋白5(DNA复制许可因子Mcm5)的作用至关重要,而在共同下调基因中,热激蛋白23(Hsp23)的作用最为关键。
研究结果为进一步探讨家蚕抵抗Bm CPV病毒侵染的免疫机制、明确不同家蚕品种的抗性差异提供了新的线索,也为深入研究其中的关键基因奠定了基础。