焦磷酸测序原理
焦磷酸测序反应
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序
Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion
焦磷酸测序技术的原理及应用
ＳＯＩ ＯＥ ＆ ＴＥ ＥＮ ＣＨＮＯＬＯＯＹ ＮＦＯＲＭＡＴＩ Ｉ ＯＮ 术的原理及应用
葛剑徽
（ 东南大学生物科学和医学工程系 ２０９ ） １０６ 摘 要：焦磷酸测序技术是由４ 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 ，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复 性和精确性能 与 Ｓ ｎ ｅ Ｎ ａ ｇｒＤ Ａ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技 术不需要凝胶 电泳 ，也不需要对 Ｄ Ａ样品进行 Ｎ 任何特殊形式的标记和染色，具备同时对大量样品进行测序分析的能力。在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医
—
长 度很短 （０—３ ｂ ２ ０ ｐ）的主要原因之一 。而 Ｇ ａ ｉａ ｅ ｈ ｒ ｄ ｈ等人对 ｚ 此进行了变革１， ７ 他们在反应体系中只加人 Ｓ — ＡＴ Ｉ ｐ ｄ Ｐ一 ０ 一Ｓ 【 ， 而 不加入无用的 Ｒｐ ｄ Ｔ — — ，提高了反应的效率 。 —ＡＰ Ｓ 大大降 低了ｄ Ｔ 一０一 降解产物的浓度 ， Ａ Ｐ 【Ｓ 使得 Ａ ｙａｅ ｐ ｒｓ酒性 能够维持
鉴定研究等方面有着越来越广泛 的应用。 美键词 ： 焦磷酸测序技术 单核苷酸 多态性 中圈分类号 ： Ｑｌ１ Ｔ ｌ 文献标识码 ： Ａ ＡＴ － 焦磷酸测 序技 术（ｙ ｏ ｑｅｃ ｇ是 由Ｎ ｒ 等人于 ｔ８年 有效地利用 ，也 能更有利于 阅读富含 Ｔ地区域。但 ｄ Ｐ ｑ— ｐ ｒｓ ｕｎｉ ） ｅ ｎ ｙｅ ｎ ７ ９ 发展起来的一种新 型的 酶联级联测序技 术［ 】 】 ，焦磷酸 测序法适 Ｓ是两种异构体 Ｓ － ＡＴ — — ｐ ｄ Ｐ Ｓ和 Ｒｐ Ａ — — －ｄ ＴＰ Ｓ的混合 ｐ ＡＴＰ — — Ｓ。为 了得到最佳反应效 于对 已知的短序列的测序分析 ， 其可重复性和精确性能与Ｓ ｎ ｅ 物 ，聚 合酶 只能利用 Ｓ －ｄ ａ ｇｒ Ｄ ＮＡ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产 品具备同时对大量样 品进行测序分析的 能力 ，为大通量 、低成 本 、适时 、快速 、直观地进行单核苷酸多态性 （ｉｇｅ ｎ ｃｅ ｓｎ ｌ ｕ ｌ— ｏｉｅ ｐ ｔｍｏｐ ｉ ，Ｓ ｓ 研究和临床检验提供 了非常理想 ｔ ｏｙ ｒ ｈｓ ｄ ｍｓ ＮＰ ） 的技术操 作平台 。 该技术进行改进后可 以满足上百个核苷酸序列 的测序工作 ， 这样该技术 又可 以满 足对重要微生物的 鉴定与分 型 ．特定 ＤＮＡ片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。 率 ，必需在 反应 体系中保持最佳浓度的 Ｓ － ＡＴ － ｐ ｄ Ｐ— Ｓ，与 此 同时 相应的 Ｒｐ ｄ Ｐ～ Ｃ — － ＡＴ ｔ Ｓ的浓度也在增加。而 ｄ ＡＴＰ － Ｓ Ａ ｙａｅ 被 ｐ ｒｓ降解后的产物是 Ａ ｙ ａｅ ｐ ｒｓ 的抑制剂 ， 随着反应 的进行 ，Ａｐ ｒ ｓ 的活性会越来越低 ，这是焦磷酸测序技术测序 ｙ ａｅ
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
焦磷酸测序
2、复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
3、延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的 四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新 的DNA链。
4、 循环特点：
① 上一链的只两 条（无引物存于两个子代DNA分 子中 ） ，其它子代DNA分子都为 双引物分子 ③ 处于两引物之间的DNA序列呈 指数增长1×2N
• 在80-100℃的温度范围内，DNA的 双螺旋结构将解体，双链分开，这个 过程称为变性；当温度缓慢降低后， 两条彼此分离的DNA链又会重新结合 成双链，这个过程称为复性。
三、复制方向（5’~3’）
1、DNA分子的3’端与5’端：-OH端 为3’; 磷酸基团的末端为5’ 。 2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核 苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键 连接而成。
焦磷酸测序
峰形图
➢ 峰高与结合模板的dNTP数量成正比 ➢ 原始数据会被软件自动转化为序列信息
✓ 高温变性 ✓ 低温退火 ✓ 适温延伸
具有特异性强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点
一、PCR反应的条件
1、一定的缓冲溶液； 2、DNA模板； 3、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4、四种脱氧核苷酸：4种dNTP混合物； 5、耐热的DNA聚合酶； 6、控制温度（PCR重要条件）。
二、DNA变性和复性
基因测序
➢ 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成DNA分子的A、 T、G、C的排列顺序。
A-T-T-C-A-C-G-G-T-AC
焦磷酸测序步骤
一 PCR 二 焦磷酸测序
PCR
➢ 聚合酶链式反应 ➢ 亦称之为DNA扩增，是 DNA复制的体外模拟
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]
![基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f61366fb84ae45c3b358c72.png)
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高 度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计 测序 PCR 试样预处理， 获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
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焦磷酸测序原理
焦磷酸测序是一种常用的测序技术，通过测序仪器对DNA序列进行快速而准确的测定。
它是一种基于合成DNA链延伸的原理，可以在短时间内测定DNA序列。
焦磷酸测序的原理是利用DNA合成过程中的焦磷酸（dideoxynucleotide）来终止链延伸的反应。
焦磷酸是一种具有缺少3'-羟基的核苷酸，它会被DNA多聚酶插入到正在合成的DNA链中，但一旦焦磷酸被插入，DNA链延伸就会停止。
这样，每次加入一个不同的焦磷酸，就可以得到具有不同长度的DNA片段。
焦磷酸测序的步骤如下：
1. DNA模板制备：首先，需要从待测DNA样本中提取出目标DNA片段。
这可以通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法来进行。
然后，将目标DNA片段加入到一个含有多聚酶和引物的反应混合物中。
2. DNA合成：在反应混合物中，加入四种不同的焦磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），以及四种普通的核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。
这样，当DNA链延伸到某个位置时，如果接下来要插入的是焦磷酸，链延伸就会终止。
3. 前序列扩增：在DNA合成过程中，每次加入的焦磷酸是不同的，因此会得到不同长度的DNA片段。
然后，将反应混合物分离成不同长度的DNA片段。
4. DNA片段分离：将反应混合物中的DNA片段进行电泳分离，根据片段大小的不同，可以得到一个DNA片段长度的分布图。
5. 数据分析：通过测序仪器对DNA片段进行测定，得到每个片段的长度信息。
根据这些信息，可以推导出DNA序列。
焦磷酸测序的优点是速度快、准确性高、适用于多种类型的样品。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、生物医学研究等领域。
然而，焦磷酸测序也存在一些限制，例如不能测定长片段的DNA，且在测序过程中容易产生误差。
焦磷酸测序是一种基于合成DNA链延伸的原理，通过插入焦磷酸来终止链延伸的反应，从而快速而准确地测定DNA序列。
它在基因组学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解DNA序列提供了有效的工具。