单次给药毒性试验
[医药]急性毒性试验
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有毒（LD50 25～ 200）
非啮齿类
（发现毒理学研究）
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怎么做？
急性毒性试验的基本要求
※两种动物 ※两种性别 ※两种给药途径
啮齿类 非啮齿类
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两种动物：充分暴露受试物毒性, 若未采 用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应 阐明其合理性。
两种给药途径：通常，给药途径应至少 包括临床拟用途径和一种能使原形药物 较完全进入循环的途径（如静脉注射）。 如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此 一种途径即可。
个途径 ※如不能静脉给药可改为其它途径
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怎么做？
剂量
※化学药物最高剂量 静脉给药：2 g/kg 口服给药：2-5 g/kg
※临床拟用剂量的100-300倍
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怎么做？
给药容量：各剂量组应按等容量，不等浓 度的给药原则
最大给药容量：可参考相关的文献
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怎么做？
口服（包括灌胃）给药前通常禁食过夜 （至少小鼠3-4 h），但不禁水，给药后 仍需禁食2-4 h（小鼠1-2 h）
原因： ※胃内容影响给药容积 ※胃内容可能会影响药物的吸收
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怎么做？
观察期限
※一般给药后连续观察14天
※如给药第2周内发生动物死亡或出现新的 毒性反应时，应延长观察期限
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怎么做？
观察终点 ※死亡 ※明显毒性征状
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怎么做？
观察指标
※死亡情况 ※体重等一般情况 ※征状（Sign） ※实验室等检查
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近似致死计量法
※方法： 选取剂量序列表中的某个区段，每个剂 量（也可每隔一个剂量）给一个动物
[医药]急性毒性试验
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（发现毒理学研究）
怎么做？
急性毒性试验的基本要求
※两种动物 ※两种性别 ※两种给药途径
啮齿类 非啮齿类
两种动物：充分暴露受试物毒性, 若未采 用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应 阐明其合理性。 两种给药途径：通常，给药途径应至少 包括临床拟用途径和一种能使原形药物 较完全进入循环的途径（如静脉注射）。 如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此 一种途径即可。
累积剂量法
※结果 ●无动物死亡：MLD（minimum lethal dose 最小致死剂量）和LD50大于最高剂量 ●某一剂量动物全部死亡：MLD和LD50在该 剂量和前一剂量间 ●某一剂量动物部分死亡，MLD在该剂量和 前一剂量间，LD50位于首次出现死亡和全 部动物死亡的剂量间
累积剂量法
※结果 ●如无动物死亡，常以最高剂量给予动物 5-7天，以确定后续的重复给药试验中高 剂量的选择
最大给药量法（限度试验）
※适用条件 ●在合理的最大给药浓度和合理的最大给 药容量的条件下仍达不到上述剂量要求 ●更高的剂量所产生的信息不具有更进一 步的价值
最大给药量法
※方法 ●一般使用10-20只动物 ●连续观察14天 ※结果 ●无动物死亡—MLD大于限度剂量 ●动物死亡<50%--LD50>限度剂量 ●动物死亡>50%需要重新设置限度剂量或改用其 他方法
上下法—主实验
※结果： 用该方法的LD50计算软件计算LD50
LD50法
※观察—观察期14天 ●观察重点：死亡 ●体重 ●征状 ※结果：分性别根据各剂量组的死亡率用 Bliss法计算LD50
固定计量法
●动物：首选大鼠 ●剂量：5、50、500和2000
mg/kg ●观察终点：明显的毒性反应 ●实验： 预试 正式实验
单次给药毒性试验
单次给药毒性试验-近似致死剂量法
• 估计可能的毒性范围：根据小动物的毒性试验 结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估 计可能引起毒性和死亡的剂量范围
• 按50%递增法，设计出含10-20个剂量序列表 • 根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂
观察指标
• 临床症状（动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物 等）
• 死亡情况（死亡时间、濒死前反应等） • 体重变化（给药前、给药期结束各称重一次，观察期间可多次称重，
动物死亡或濒死时称重 • 记录所有死亡情况，出现症状以及症状的起始时间、严重程度、持续
时间、体重变化等 • 进行大体解剖（所有动物），当组织器官出现体积、颜色、质地等改
单次给药毒性试验
单次给药毒性试验 （Single dose toxicity study）
• 定义
– 是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反 应而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或 24小时内多次给予受试药物后，一定时间内所 产生的毒性反应
单次给药毒性试验目的意义
• 了解新药急性毒性强度 • 计算新药相对毒性参数 • 为临床毒副反应监护提供参考依据 • 为进一步毒性试验选择剂量提供依据 • 其它方面
• 近似致死量法 • 最大给药量法 • 最大耐受量法 • 固定剂量法 • 上下（序贯法） • 累积剂量法（金字塔法） • 半数致死量法
定义
• 最大给药量（MFD）：指动物单次或24小时内多次（2-3次）给药所采用的最 大给药剂量
• 最大耐受量法（Maximal tolerance dose, MTD)：是指动物能够耐受的而不引起 动物死亡的最高剂量；是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量
简述 药物急性毒性试验研究主要设计要点
简述| 药物急性毒性试验研究主要设计要点急性毒性（Acute toxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应。
拟用于人体的药物通常需要进行单次给药毒性试验。
单次给药毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。
单次给药毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量所致急性中毒相关的信息。
实验设计注意事项01受试物受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并须有研制单位的COA。
来自于市售的辅料、溶媒等应具有相关的说明和规格。
02实验动物年龄| 试验应使用年轻健康成年的动物，如果是儿童用药，必要时采用幼年动物进行试验。
种属| 可根据药代或药效结果选择合适的动物种属，试验应采用至少两种哺乳动物，从多个方面暴露药物动物毒性，选择一种啮齿类和一种非啮齿类动物，如未采用非啮齿类动物进行动物试验，应该说明理由。
性别| 通常采用雌性和雄性动物进行试验，雌雄各半。
若采用单性别动物进行试验，应阐明其合理性。
动物数| 根据研究目的，选择合适的动物数，比如小动物每组动物10只，大动物每组动物4只。
动物数应符合试验方法及其结果分析评价的需要。
体重| 试验中的啮齿类动物初始给药时的每组平均体重差异不应超过或低于平均体重的20%。
03给药途径通常情况下给药途径应至少包括临床拟用途径，或者增加一种能使药物较为完全进入全身暴露的途径如静脉给药。
急性经口给药前啮齿类动物应禁食一段时间，但禁食时间可能会影响暴露量，受到药物代谢酶的活性和受试物肠道内吸收的影响。
04给药剂量水平常用的试验方法有最大给药量法、最大耐受量法、半数致死量法等。
根据不同的试验方法选择合适的剂量，为了充分暴露毒性，高剂量可选择出现严重毒性的给药剂量或达到最大给药量，低剂量可选择未见毒性剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。
全身用药的毒性评价
（三）观察时间及指标
观察时间
• 给药后几小时内应严密观察动物反应，以 后每天上下午各观察一次
• 急性毒性试验必须观察7-14天，一般不超 过两周
（三）观察时间及指标
观察指标
给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观 察异常应毒每性日症记状录包体括重①、行毒动性：反不应安和定死、亡多情动况、，发濒死 声；②动 和神物 病经应 理系单 组统独 织反饲学应养观：，察举死。尾后试、及验振时结颤解束、削存痉进 活挛行 动、肉 物运眼 也动观 进失察 行 调、姿解态剖异，常如；有③病自变主进神行经组系织统学反观应察：。眼球突出、 流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼 吸；④死亡。
• 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受 试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行
• 如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先 用雌性动物进行预试。
（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）
• 根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择 一个作为初始剂量
• 若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为 初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束 预试。
<50%，LD50>限度剂量；3）死亡率>50%，重新设 计。
（一）最大给药量试验
以小鼠口服为例： 动物数不得少于10只，雌雄各半，容量一次不 超过0.4ml/10g(体重)，多次给药间隔时间不 低于4h，观察14日，记录毒性反应和体重变化。 如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为 该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50 大于最大给药量。
目 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 的 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护
急性毒性试验
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。
一、啮齿类动物单次给药的毒性试验（一）试验条件1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。
选用其他动物应说明原因。
年龄一般为7-9周龄。
同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。
2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。
若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。
应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。
3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。
（二）试验方法：由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。
1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。
2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。
3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。
4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。
选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。
实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。
如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。
根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。
(完整版)急性毒性试验
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。
一、啮齿类动物单次给药的毒性试验（一）试验条件1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。
选用其他动物应说明原因。
年龄一般为7-9周龄。
同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。
2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。
若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。
应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。
3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。
（二）试验方法：由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。
1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。
2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。
3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。
4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。
选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。
实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。
如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。
根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。
布洛芬注射液小鼠单次腹腔注射给药毒性的试验研究
布洛芬注射液小鼠单次腹腔注射给药毒性的试验研究目的观察布洛芬注射液单次腹腔注射以后小鼠的急性中毒反应。
方法试验采用ICR小鼠，给药后观察出现的各种应激反应和临床中毒症状。
连续观察14d后将动物安乐死，对肉眼所见异常的组织器官进行组织病理学检查。
结果给药后，小鼠出现活动减少、困倦、趴伏、呼吸减少的症状。
550、467、397、337mg/kg 组死亡动物数分别为10、9、2、1，动物死亡数随着剂量降低而减少；287mg/kg 组及溶媒对照组未见动物死亡。
结论按Bliss法计算，布洛芬注射液小鼠单次腹腔注射给药的LD50和95%可信区间为414.39mg/kg，385.17～445.89。
[Abstract] Objective To evaluate the acute toxicity of Caldolor on ICR mice. Methods After treatment，the animals were observed daily for totally 14 days. Stress reactions and clinical symptoms were observed and recorded. At the end of the observation period，the mice were sacrificed，necropsied and the major organs were taken out for pathological examination. Results After treatment，the mice appeared abnormal clinical signs such as reduced activity，sleepiness，reduced respiration. The number of dead mice for 550，467，397，337 mg/kg group were 10，9，2 and 1，respectively; There were no mouse dead in 287 mg/kg group and in the vehicle control group. Conclusion Calculated by Bliss，50% lethal dose（LD50）of intraperitoneal Caldolor in mice is 414.39 mg/kg and the 95% confidence interval is 385.17-445.89.[Key words] Caldolor；Acute Toxicity；LD50布洛芬是一个较强的前列腺素合成抑制剂，以抗炎、解热和镇痛效果确切、不良反应小等优点被广泛应用，成为全球最畅销的非处方药物之一[1-3]。
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等）
• 死亡情况（死亡时间、濒死前反应等） • 体重变化（给药前、给药期结束各称重一次，观察期间可多次称重，
动物死亡或濒死时称重
• 记录所有死亡情况，出现症状以及症状的起始时间、严重程度、持续 时间、体重变化等 • 进行大体解剖（所有动物），当组织器官出现体积、颜色、质地等改 变时，应进行组织病理学检查
结果分析与评价
• 根据上述观察指标的结果判断受试物引起 的毒性反应性质、严重程度、可恢复性及 安全范围 • 根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖 和组织病理学检查结果，初步判断毒性靶 器官。
试验目的和意义-新药急性毒性强度
动物及给药途径 剧毒 毒 有害
大鼠LD50 ig（mg/kg)
≤25
25-200
200-2000
大鼠或兔经皮LD50 （mg/kg)
≤50
50-400
400-2000
大鼠LC50（mg/L/4h)
≤0.5
0.2-2
2-20
试验目的和意义-相对毒性参数
• • • • 治疗指数TI=LD50/ED50 安全系数SF=LD5/ED95 可靠或确实安全系数CSF=LD1/ED99 LD50/ED50，越大越安全
给药方法
• 动物禁食
– 为减少吸收差异和大容量给药造成急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4-6h，要求一夜停
食（不停水），给药后再禁食3-4h
•
给药途径
– 中药新药除临床给药途径外，一、二类水溶性药应同时采用静脉给药途径，其他如油剂、 混悬剂之类可擦爱用皮下给药途径。腹腔注射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动 物毒性试验中也尽可能少用，以避免腹腔刺激性的干扰。
• 根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂 量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只 动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量， 然后用二者之间的剂量给一只动物，此剂量即 为所要求的近似致死剂量
单次给药毒性试验要求
• 试验动物
– 啮齿类：大鼠或小鼠 – 非啮齿类：犬、猴或其它
• 作为一类创新药物必须用两种动物（啮齿 类和非啮齿类）；其它类酌情用二种动物 • 动物体重：小鼠18-22g，同次体重相差不超 过平均体重20%；大鼠120-150g，同次体重 不超过平均体重20%；犬用成年犬 • 性别：雌雄各半
单次给药毒性试验
单次给药毒性试验 （Single dose toxicity study）
• 定义
– 是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反
应而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或
24小时内多次给予受试药物后，一定时间内所
产生的毒性反应
单次给药毒性试验目的意义
• • • • • 了解新药急性毒性强度 计算新药相对毒性参数 为临床毒副反应监护提供参考依据 为进一步毒性试验选择剂量提供依据 其它方面
– LD50法（1/10，1/50，1/100） – MTD法（1，1/3，1/10)
• 蓄积性毒性剂量设计
– 1/10LD50，然后按等比级数1.5倍逐渐递增
试验目的和意义-为特殊毒性试验剂量选择提供依据
– 生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD
– 致突变试验
• 啮齿类动物微核试验高剂量为1/2 LD50 • 精原细胞染色体畸变试验高剂量应为1/2 LD50
• • • • • • • 近似致死量法 最大给药量法 最大耐受量法 固定剂量法 上下（序贯法） 累积剂量法（金字塔法） 半数致死量法
定义
• 最大给药量（MFD）：指动物单次或24小时内多次（2-3次）给药所采用的最 大给药剂量 • 最大耐受量法（Maximal tolerance dose, MTD)：是指动物能够耐受的而不引起 动物死亡的最高剂量；是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量 • 半数致死量（Median lethal dose, LD50）：预期引起50%动物死亡的剂量，该 值是统计学处理推算出的结果 • 单次口服固定剂量法：选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂基本有效量 – ED99肯定有效量
试验目的和意义-为临床毒副反应监护提供参考
• • • • •
中毒症状 起始时间 持续时间 恢复时间 对抗试验为临床急救提供依据
试验目的和意义-为重复给药、蓄毒试 验剂量选择提供依据 • 重复给药毒性剂量设计
– 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄 性动物对受试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，
单次给药毒性试验-LD50法
• LD50测定法剂量设计
– 预试验：找出0%及100%估计致死量 – 正式试验：根据预试验药物毒性大小一般在1:0.6-1:0.9范围
– 动物短期致癌试验高剂量应是MTD – 主要药效学剂量限度、安全药理和药代动力学 剂量也要参考急性毒性的LD50
试验目的和意义-其它方面
• 系列化合物的合格率分析（除理化性质为 主外）也参考LD50
• 复方中药物的相互作用，有时也通过拆方 及合用的LD50来判别相互作用的性质
单次给药毒性试验常用试验方法
内设计4-7档剂量
• LD50计算方法
– Bliss法 – 改进寇氏法 – 点斜法
– 简化概率单位法
单次给药毒性试验-最大给药量法
• 最大体积的给药量1次或1日内2-3次给予动 物，以小鼠为例容量一次不超过0.4ml/10g， 多次给药间隔时间不低于4h。
单次给药毒性试验-近似致死剂量法
• 估计可能的毒性范围：根据小动物的毒性试验 结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估 计可能引起毒性和死亡的剂量范围 • 按50%递增法，设计出含10-20个剂量序列表
•
各给药途径的容量
– 小鼠一般：0.4-0.5ml/20g，大鼠1ml/100g
– 小鼠最大：口服不超过0.8ml/20g，其他途径不超过0.5ml/20g
– 大鼠最大：口服不超过2ml/100g，其他途径不超过1ml/100g
观察指标
• 临床症状（动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物