6酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液(ANAE)(ICSH推荐法)
大鼠骨髓巨噬细胞的分离_纯化_培养以及鉴定_李静
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定李静,王亚平(重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016)=摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。
方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。
采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。
结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。
=关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定=中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24Methodology of separation,purification,cultivation an didentification of rat bone marrow macrophageLI Jing,et al(Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage.=Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification巨噬细胞是机体的重要防御细胞。
青海藏族青年外周血淋巴细胞酸性a——醋酸萘酯酶反应类型及其正常值的探讨
青海藏族青年外周血淋巴细胞酸性a——醋酸萘酯酶反应类型
及其正常值的探讨
王索安;杨风乡;等
【期刊名称】《青海医学院学报》
【年(卷),期】1993(014)003
【摘要】本文用酸性a--醋酸萘酯酶（ANAE）反应标记淋巴细胞的化学方法，对青海105例正常藏族青年外周血淋巴细胞ANAE阳性率进行了观察，发现试验对象外周血淋巴细胞的ANAE总阳性率为77．8±6．61％，并按三种酶型进行统计分析，其中ANAE反应为1－3个“点状颗粒型”的淋巴细胞百分率为
51．15±8．72，4－8个“点状颗粒型的淋巴细胞百分率为18．5±6．94，弥散型的淋巴细胞百分率为8．26±5．18，同时比较了不同性别的正常值及酶型变化，并在方法上进行了探讨。
【总页数】6页(P167-172)
【作者】王索安;杨风乡;等
【作者单位】病理教研室;组胚教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
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杨风乡
3.用酸性α—醋酸萘酯酶染色法测定儿童外周血T淋巴细胞 [J], 陈毓玲;葛桂秀
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酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液
酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液（ANAE）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下水解α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色主要组成成分：储存条件及有效期：有效期：一年储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。
样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是33ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入D液40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是1.65ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。
操作：于试管内加B液50μL，C液50μL混匀，静置1分钟，再加D液1.5ml，E液50μl,混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。
二、染色步骤1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干（涂片不固定直接做ANAE染色，阳性反应强于固定者）；2、滴加或浸入工作液布满涂片（37℃）孵育分钟，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干3、F液复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检参考范围：1.单核细胞系统：呈阳性反应，其反应可被氟化钠抑制。
2.粒细胞系统：各期粒细胞多呈阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，其反应不被氟化钠抑制。
3.巨核细胞及血小板为阳性。
4.淋巴细胞多呈点状阳性，部分淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。
5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。
6.幼红细胞呈阴性反应。
细胞化学染色检验
细胞化学染色检验摘要】细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。
它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质(酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。
【关键词】血液细胞染色检验过氧化物酶(peroxidase，POX)染色方法有Washburn法、四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等。
前者曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，故现常用后两者，下面分别介绍这两种方法的原理。
四甲基联苯胺法粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，POX能分解 H2O2而释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。
改良的Pereira染色法粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧，使碘化钾氧化生成碘，碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀，定位于酶活性的细胞质内。
1 苏丹黑染色原理苏丹黑B(Sudan black B，SBB)是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构(如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)中，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。
脂类物质在粒细胞中丰富，单核细胞中也有少量。
2 中性粒细胞碱性磷酸酶染色原理中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase，NAP)染色的方法有G0mori钙-钴法和Kaplow偶氮偶联法，因为钙-钴法操作较为繁琐且所需时间长，而偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法。
Kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH 9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。
不同的底物与重氮盐的组合不同，化学反应过程以α-醋酸萘酚钠为例。
3 酸性磷酸酶染色原理酸性磷酶(acid phosphatase，ACP)存在于细胞的溶酶体颗粒中，有的细胞中酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。
血液酸性α-醋酸萘酯酶染色方法改进
血液酸性α-醋酸萘酯酶染色方法改进
朱辛为;李质馨;窦肇华;蒙一纯;鲁质傅;文天秀
【期刊名称】《吉林医药学院学报》
【年(卷),期】1995(000)003
【摘要】1 方法用酸性α-醋酸萘酯酶法(简称ANAE法)检测血液中的T淋巴细胞及其亚群,以观察机体的细胞免疫功能,已广泛用于组织学中的细胞化学及相关的动物实验中.由于α-醋酸萘酯酶易受时间、温度及pH值等多种因素的影响,故作者在常规染色的基础上,对几个主要步骤进行了改进,效果较好.其方法是:(1)取末梢血制成涂片,室温干燥;(2)于4℃甲醛-丙酮固定液(pH6.0)固定45s;
【总页数】1页(P203-203)
【作者】朱辛为;李质馨;窦肇华;蒙一纯;鲁质傅;文天秀
【作者单位】空军医学高等专科学校!吉林市132011
【正文语种】中文
【中图分类】R446.113
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5.用酸性α—醋酸萘酯酶染色法测定儿童外周血T淋巴细胞 [J], 陈毓玲;葛桂秀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酶类染色液
酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。
适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。
染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
酸性α醋酸萘酯酶染色法
酸性α 醋酸萘酯酶染色法一、原理淋巴细胞内含有许多种酶，如α 醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β 葡萄糖苷酸酶等。
不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。
T淋巴细胞浆内含有的酸性α 醋酸萘酯酶(acid α naphthyl acetate esterase，ANAE) ，在弱酸性条件下，能使底物酸性α 醋酸萘酯水解成醋酸和α 萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。
B淋巴细胞则无此种反应。
因此ANAE染色法可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。
此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。
二、材料和方法(一) 材料1 2 5%戊二醛溶液(固定液)在0 1mol/L pH值7 4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。
2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。
3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。
4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。
充分混合，1min后备用。
5 α 醋酸萘酯溶液：α 醋酸萘酯2g乙二醇单甲醚100ml也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。
6 0 067(1/15)mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液：甲液KH 2PO 4 9 08g加蒸馏水至1，000ml乙液Na 2HPO 4 9 74g加蒸馏水至1，000ml。
(如为Na 2HPO 4·12H 2O则称取2322g)取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0 067mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液。
实验12 单增李斯特菌感染对小鼠脾脏ANAE+淋巴细胞的影响
生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞浆中该酶所在部 位，经甲基绿复染，呈现单一或散在的颗粒或斑块，呈棕红色，
B淋巴细胞无此反应，该方法可作为T淋巴细胞的鉴别方法之一。
四、实验目的
（1）了解单核巨噬细胞的基本功能 （2）了解细菌感染与单核巨噬细胞增多之间的关系 （3）单核巨噬细胞染色的原理和染色方法
五、实验步骤
1：制备BHI液体和固体培养基，分别分装试管和倾倒平板。
2：保存的单增李斯特菌菌种（以下简称细菌）10μl，接种2支
5ml BHI液体培养基，37℃培养过夜，以复苏细菌。 3：划线固体平板培养基，37℃培养2天。 4：挑单克隆，接种液体培养基，37℃培养过夜。分光光度仪 测定培养物的OD600，以空白BHI调零。按OD600为1时，1ml
9：另取一空白离心管，其中加入2ml淋巴细胞分离试剂（聚蔗
糖-泛影葡胺），用移液器吸取上述悬浮细胞，沿管壁近液面处缓
慢加入，不要破坏液面平衡。2000 rpm, 离心10min.轻轻取出离
心管（不要剧烈），可见分层（从上到下依次为MEM、交界处的 淋巴细胞、淋巴细胞分离液，沉淀为红细胞和碎片），取淋巴细 胞层，加MEM至3ml， 2000rpm 5min,1ml MEM 悬浮。 。
6：断颈致死小鼠，标记好小鼠（细菌接种数），酒精棉球消毒小 鼠，剖腹取脾脏，在平皿中用剪刀剪成4-5块，然后用镊子移放在
200目的铜网上。
7：在脾脏上加2ml细胞基础培养基MEM,用注射器芯轻轻研磨脾脏
至只有结缔组织时，再用少量MEM冲洗一下。
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1.检验原理
盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下分解产生α-萘酚，α-萘酚与六偶氮副品红结合生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称非特异性酯酶染色。
2.主要组成成分
组成主要成分
2.1、固定剂（A液）甲醛
2.2、偶氮溶液（B液）副品红
2.3、亚硝酸钠溶液（C液）亚硝酸钠
2.4、磷酸盐缓冲溶液（D液）磷酸盐
2.5、α-醋酸萘酚溶液（E液）α-醋酸萘酚
2.6、甲基绿溶液（F液）甲基绿
2.7、NaF溶液氟化钠
3.储存条件及有效期
有效期：一年（十二个月）。
储存条件：本试剂盒应储存于2～8℃低温环境。
4.样本要求
新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。
5.检验方法
5.1. 工作液配制：
5.1.1. 浸染工作液配制（一份浸染工作液量为33ml,至少可同时放置8-10张涂片）：
5.1.1.1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；
5.1.1.2、染缸（自备染液缸）内加入D液30ml;
5.1.1.3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀；
5.1.1.4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀。
B液C液D液E液 NaF液
A染缸1ml 1ml 30ml ml ——
B染缸（抑制试验）1ml 1ml 30ml 1ml 40mg
5.1.2. 滴染工作液配制（一份滴染工作液量为1.65ml）；
使用器材：一次性塑料试管、微量移液器、一次性吸嘴、滴管。
操作：于试管内加B液50ul、C液50ul 、混匀，静置1分钟；再加D液1.5ml,E液50ul，混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。
B液C液D液E液 NaF液
A染缸50μl 50μl 1.5ml 50μl ——
B管（抑制试管）50μl 50μl 1.5ml 50μl 1滴
注：100Tests中的15mlD液（浓缩缓冲液）用蒸馏水稀释成150ml缓冲液使用。
5.2.染色步骤：
5.2.1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液固定涂片30秒，蒸馏水冲洗，待干编写：杨松钱审核：黄萱批准：白云辉页码：17
或滤纸吸干。
（涂片不固定直接做ANAE染色，阳性反应强于固定者）
5.2.2、滴加或浸入工作液布满涂片（37℃）孵育30分钟，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干。
5.2.3、F液复染1～2分钟，蒸馏水冲洗，待干后镜检。
6.临床意义
6.1.阳性:单核细胞和组织细胞呈强阳性,但可被氟化钠抑制;巨核细胞及血小板呈阳性;早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞可阳性,且不受氟化钠抑制.
6.2.弱阳性及阴性:粒细胞,淋巴细胞一般为阴性,若有弱阳性也可被氟化钠抑制.
6.3.临床鉴别:主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病,前者NSE阳性,且受氟化钠(NaF)抑制;而后者NSE阴性,若有阳性也不受氟化钠抑制.
7.注意事项
7.1、5Tests只限滴染使用。
7.2、本染色又名酸性非特异性酯酶染色。
7.3、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B、C液请充分混匀，所用容器必须洁净。
7.4、工作液临用前新鲜配制，应采用新鲜涂片做染色。
7.5、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果。
7.6、本品应由专业人士使用及进行结果的判读。
7.7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护。
7.8、生产批号、有效期见外包装。
7.9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。
8.参考文献
8.1、中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程〔M〕.第3版.南京：东南大学出版社，2006
8.2、Gradwohl’s Clinical Laboratory Methods And Diagnosis,8th,ed.
编写：杨松钱审核：黄萱批准：白云辉页码：18。