酸性α-乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)使用说明
SOP文件酯酶染色中性非特异性脂酶αNAE染色
SOP文件酯酶染色中性非特异性脂酶αNAE染色1. 引言本SOP文件旨在描述酯酶染色中使用的中性非特异性脂酶αNAE染色方法。
中性非特异性脂酶αNAE是一种酯酶，广泛存在于许多生物体中。
该酶在许多生理和病理过程中起着重要作用，因此其检测和定量对于研究和临床应用具有重要意义。
2. 实验材料•甲醇（CH3OH）•乙醇（C2H5OH）•碘酒（I2）•活化碳（C）•磷酸氢钾（KH2PO4）•污染物样品3. 实验步骤步骤1：制备甲醇和乙醇溶液1.取适量的甲醇和乙醇，分别加入两个容器中。
2.分别将甲醇和乙醇容器标记为“甲醇溶液”和“乙醇溶液”。
步骤2：制备碘酒溶液1.取适量的碘酒，加入一个容器中。
2.将该容器标记为“碘酒溶液”。
步骤3：制备活化碳溶液1.取适量的活化碳，加入一个容器中。
2.将该容器标记为“活化碳溶液”。
步骤4：制备磷酸氢钾缓冲液1.取适量的磷酸氢钾，加入蒸馏水中，搅拌至完全溶解。
2.将溶液调节至pH 7.0，并标记为“磷酸氢钾缓冲液”。
步骤5：制备实验样品1.取适量的污染物样品，加入离心管中。
2.加入适量的磷酸氢钾缓冲液，使样品浓度适宜。
步骤6：进行染色实验1.取一块载玻片，将其置于实验台上。
2.取一滴甲醇溶液，滴在载玻片上。
3.将样品与甲醇溶液混合，使其均匀分布于载玻片上。
4.将载玻片置于离心机中，进行离心，以去除残留液体。
5.取一滴乙醇溶液，滴在载玻片上。
6.将载玻片置于离心机中，进行离心，以去除残留液体。
7.取一滴碘酒溶液，滴在载玻片上。
8.将载玻片置于离心机中，进行离心，以去除残留液体。
9.取一滴活化碳溶液，滴在载玻片上。
10.将载玻片置于离心机中，进行离心，以去除残留液体。
步骤7：观察和分析结果1.取一滴适宜的显微镜油，滴在载玻片上。
2.取显微镜封片，将其覆盖在载玻片上。
3.使用显微镜观察载玻片下的染色结果。
4.记录观察结果，并进行结果分析。
4. 结论本实验SOP文件描述了酯酶染色中性非特异性脂酶αNAE染色的方法。
α-醋酸萘酚酯酶染色
α-醋酸萘酚酯酶染色
α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）属于酯酶染色的一种。
（1）原理：血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）将基质液中的α-醋酸萘酚水解，产生α-萘酚，萘酚再与坚牢蓝B偶联，形成不溶性灰黑色或棕黑色沉淀，定位于胞质内。
属于非特异性醋酸染色。
（2）结果判断：染色阳性结果为胞质中出现棕黑色颗粒沉淀。
（3）正常血细胞的染色反应
1）单核细胞系统原始单核细胞为阴性反应或弱阳性反应；幼单核细胞和单核细胞为阳性反应，这种反应可被氟化钠抑制。
2）粒细胞系统各期粒细胞为阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，此反应不被氟化钠抑制。
3）巨核细胞和血小板为阳性反应。
4）其他血细胞幼红细胞和淋巴细胞一般为阴性反应，有时少数细胞也可是弱阳性反应，此反应不被氟化钠抑制；浆细胞为阴性反应。
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（4）临床意义
1）帮助鉴别急性白血病的类型：单核细胞白血病时，白血病原始单核细胞可呈阳性反应，幼单核细胞和单核细胞大多呈阳性反应，此反应能被氟化钠抑制，抑制率在50%以上；急性粒细胞白血病时，白血病原始粒细胞为阴性反应，有时个别白血病原始粒细胞可呈阳性反应，但此反应不被氟化钠抑制；急性淋巴细胞白血病时，白血病原始淋巴细胞为阴性反应，有时原始淋巴细胞可出现阳性反应，主要见于T细胞型急淋；急性粒-单核细胞白血病时，部分原始白血病细胞呈阳性反应，并能被氟化钠抑制，这些白血病细胞可能是单核细胞系细胞，部分白血病细胞呈阴性反应，可能是粒细胞系细胞。
2）红血病和红白血病：异常幼红细胞可呈阳性反应。
3）巨幼细胞贫血：巨幼细胞也可呈阳性反应。
酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液
酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液（ANAE）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下水解α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色主要组成成分：储存条件及有效期：有效期：一年储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。
样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是33ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入D液40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是1.65ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。
操作：于试管内加B液50μL，C液50μL混匀，静置1分钟，再加D液1.5ml，E液50μl,混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。
二、染色步骤1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干（涂片不固定直接做ANAE染色，阳性反应强于固定者）；2、滴加或浸入工作液布满涂片（37℃）孵育分钟，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干3、F液复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检参考范围：1.单核细胞系统：呈阳性反应，其反应可被氟化钠抑制。
2.粒细胞系统：各期粒细胞多呈阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，其反应不被氟化钠抑制。
3.巨核细胞及血小板为阳性。
4.淋巴细胞多呈点状阳性，部分淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。
5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。
6.幼红细胞呈阴性反应。
血液酸性α-醋酸萘酯酶染色方法改进
血液酸性α-醋酸萘酯酶染色方法改进
朱辛为;李质馨;窦肇华;蒙一纯;鲁质傅;文天秀
【期刊名称】《吉林医药学院学报》
【年(卷),期】1995(000)003
【摘要】1 方法用酸性α-醋酸萘酯酶法(简称ANAE法)检测血液中的T淋巴细胞及其亚群,以观察机体的细胞免疫功能,已广泛用于组织学中的细胞化学及相关的动物实验中.由于α-醋酸萘酯酶易受时间、温度及pH值等多种因素的影响,故作者在常规染色的基础上,对几个主要步骤进行了改进,效果较好.其方法是:(1)取末梢血制成涂片,室温干燥;(2)于4℃甲醛-丙酮固定液(pH6.0)固定45s;
【总页数】1页(P203-203)
【作者】朱辛为;李质馨;窦肇华;蒙一纯;鲁质傅;文天秀
【作者单位】空军医学高等专科学校!吉林市132011
【正文语种】中文
【中图分类】R446.113
【相关文献】
1.血清酸性α-醋酸萘酯酶的比色测定及初步临床应用 [J], 冯春来;黄兴富;范华
2.肝硬化患者血清和腹水中酸性α-醋酸萘酯酶的含量 [J], 王燕;周力;张永宏;张维;陈玉梅
3.酸性α-醋酸萘酯酶染色法的改良 [J], 卢曦;刘艳芬;刘铀
4.酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中的应用研究 [J], 张国军;王高
学;潘厚军;石存斌;吴淑勤
5.用酸性α—醋酸萘酯酶染色法测定儿童外周血T淋巴细胞 [J], 陈毓玲;葛桂秀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中的应用研究
ｎｔ ｅ ｅ ｎ ｉ ｉ ｌｖ ｌｉ ｍｍｕ ｉｅ ｉ ｉｅｃ ｈ ｕ ｔ ｗａ ｅ ｔｄ ｉ ｈ ｓｐ ｐ ｒ Ｆ ｃ ｌ —Ｕｒ ｇ ｆ ｒ ｄ ｅ ｔｓ ｌ ｔ ｎ ｗｉ ｉ ｅ ｅ ｔｄ ｎ ｉ ｙ ｎｚ ｄ Ｓ ｎｐ ｒａ ｃ ａ ｓｉ ｓｔｓｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｅ ． ｉｏｌ ａ ａ ｎ ｇａ ｉｎ ｏ ｕｉ ｔ ｄ ｆ ｒ ｎ ｅ ｓｔ ｉ ｏ ｈ ｆ ｙ
张国 ， 学 ， 军 ， 存 吴 军 王高 潘厚 石 斌 ， 淑勤
（．西北农林科技 大学 ，陕西杨凌 ７ ２０ ； １ １１０ ２ ．中国水产科学研 究院珠江水产研究所 ，广州 ５０ ８ ） １３ ０
摘 要 ：研究 了酸性 一醋酸萘 酯酶染 色法在鳜 细胞 免疫水 平检测 中应 用 的可行性 。用不 同 比重 的淋 巴细胞 分
ｔ ｅ ｂ ｓ ｒ ｓ ｌ ｉ ｓ ｌ ｔ ｎ ＡＮ ｓｕ ｅ ｏ ｓ ｉ ｈ ｓ ｌｔ ｄ ｌｍｐ ｏ ｙｅ ｎ ｔｉｄ ｃ ｔｄ ｔ ａ ｅ ｏ ｔ ｌ ｔ ｉ ｉ ｇｃ ｎ ｈ ｅ ｔ ｅ ｕ ｔ ｎ ｉｏａ ｉ ． ｏ ＡＥ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｔ ｎ ｔ ｅ ｉ ａｅ ａ ｏ ｙ ｈ ｃ ｔｓａ ｄ ｉ ｎ ｉａｅ ｈ ｔｔ ｐ ｉ ｈ ｍａ ｓａ ｎｎ ｏ —
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第３ ６卷 第 ３期
Ｖ０＿ ６ ｌ３
Ｎｏ ３ ．
淡
水
酶类染色液
酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。
适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。
染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
酸性α醋酸萘酯酶染色法
酸性α 醋酸萘酯酶染色法一、原理淋巴细胞内含有许多种酶，如α 醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β 葡萄糖苷酸酶等。
不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。
T淋巴细胞浆内含有的酸性α 醋酸萘酯酶(acid α naphthyl acetate esterase，ANAE) ，在弱酸性条件下，能使底物酸性α 醋酸萘酯水解成醋酸和α 萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。
B淋巴细胞则无此种反应。
因此ANAE染色法可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。
此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。
二、材料和方法(一) 材料1 2 5%戊二醛溶液(固定液)在0 1mol/L pH值7 4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。
2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。
3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。
4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。
充分混合，1min后备用。
5 α 醋酸萘酯溶液：α 醋酸萘酯2g乙二醇单甲醚100ml也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。
6 0 067(1/15)mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液：甲液KH 2PO 4 9 08g加蒸馏水至1，000ml乙液Na 2HPO 4 9 74g加蒸馏水至1，000ml。
(如为Na 2HPO 4·12H 2O则称取2322g)取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0 067mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液。
酸性α—醋酸萘酯酶
实验五：酸性α—醋酸萘酯酶一、实验目的和要求：1、掌握酸性α—醋酸萘酯酶实验的原理及在免疫学方面的应用；2、学会应用该实验方法鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用。
二、实验内容：鉴别人和鼠中T、B淋巴细胞。
三、实验步骤：1、配制试剂。
A液：PH7.6的磷酸盐缓冲液：甲液：将9.08克的磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中；乙液：将23.88克十二水合磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中；取甲液12mL加乙液88mL即成磷酸盐缓冲液。
B液：4%副品红溶液：将4克副品红溶于100mL2M盐酸内，溶解过滤，4℃保存。
C液：4%亚硝酸钠溶液：取0.4克亚硝酸钠溶于10mL蒸馏水中，现用现配。
D液：2%醋酸ɑ萘酯液：取2克醋酸ɑ萘酯，溶于100mL无水丙酮中，溶解后装棕色瓶，4℃保存。
孵育液：将2.4mLC缓慢滴入到2.4mLB中，震荡混匀，静置5min，之后将此溶液加进80mLA液中，混匀，滴入2mLD，调PH5.8-6.0。
1%孔雀石绿染液：将1克孔雀石绿溶于100mL蒸馏水中，用氯仿处理后4℃保存。
2、血液涂片取一只小鼠，断尾采血，涂抹于洁净玻片，编号为D，血液层越薄越好，另外手指尖取血涂片，编号D1。
3、孵育和染色待血液自然干燥后置于孵育液内，37℃孵育90min，水冲洗5min，孔雀石绿复染1min，流水冲洗，干燥后，制片显微镜观察（用油镜）。
4、结果判定淋巴细胞胞浆内出现大小不等、数量不一的深红色颗粒者为ANAE阳性细胞（T细胞），胞浆内无颗粒者为ANAE阴性细胞（B细胞）。
四、实验结果2、分析和讨论人的TB淋巴细胞相对于小鼠的都比较大，但是形态相似，胞浆内呈现大小不一的红色颗粒为T细胞，B细胞，胞核比较搭，几乎占据整个细胞。
五、作业酸性α—醋酸萘酯酶在兽医临床上有何应用？在免疫学方面的应用，检测TB淋巴细胞的活性，鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用，ANAE测定可作为评价肝细胞损伤、肝纤维化以及肝脏合成功能异常的一项新的血清学指标。
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酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)使用说明
货号：G2390
规格：3×10ml
保存：有效期6个月。
产品内容：
试剂A：ANAE固定液10ml RT避光
试剂B；ANAE孵化液B1：pararosaniline solution0.05ml4℃避光
B2：Nitrite solution0.05ml4℃避光
B3：α-NAE solution0.5ml4℃避光
B4：ANAE buffer9.5ml4℃避光
临用前，按B1：B2：B3：B4=1：1：10：190充分混合，即为ANAE孵化液，即配即用。
注意应先B1：B2=1:1混匀后，再与B3、B4混匀。
试剂C:甲基绿染色液10ml RT避光
试剂D：NaF solution0.2ml RT避光
自备材料：
载玻片、湿盒、显微镜
产品简介：
酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)酸性α-乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是酸性条件下细胞中的酸性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与六偶氮副品红偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于细胞质。
酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)对酯酶
染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。
该染色液仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
操作说明：
1.血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片入ANAE固定液固定10-15min。
2.水洗5min。
3.入配置好的ANAE孵育液，放入湿盒中，室温避光孵育1h，水洗。
4.入甲基绿染色液复染5-15min，水洗，镜检。
染色结果：
细胞质暗红色/棕色
细胞核绿色
氟化钠抑制实验：
按NaF solution：ANAE孵育液=1：25的比例，在ANAE孵育液中加入NaF solution，其余按上述染色法进行。
注意事项：
1.血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。
2.ANAE孵育液易失效或降低阳性程度，即配即用，不宜久置。
3.ANAE孵育液配置后易出现浑浊，但不会影响染色效果。
4.单核细胞为中度阳性至强阳性，对NaF敏感。
正常粒细胞呈阴性反应。
5.每次染色时，应有阳性对照。