实验五过氧化物同工酶PAGE分析
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶一、研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 A液（30%Acr-0.8%Bis） B液（Tris+EDTA） C液（TEMED） D液（10% AP）
含量 2.65mL 4.75mL
10μL 50μL
作用 交联剂 缓冲液 加速剂 催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵
内，加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中 研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上 以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正
极)。打开电源开关，调节电压，以 10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴 酚蓝下行至距胶板末端1-2 厘米处，即可 停止电泳。
实验五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶temp
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g水稻种子置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
6、剥胶、染色
1种利用SDS_PAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法
表 ２ ５ 种菖蒲的 ＰＡＧＥ 同工酶电泳结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｌｅｃｔｒ ｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ ｒ ｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＡＧＥ ｉｓｏｚｙｍｅ ｆｒ ｏｍ ｆｉｖｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ａｃｏｒｕｓ Ｌ．
同工酶带 Ｉｓｏｚｙｍｅ ｂａｎｄ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ
藏菖蒲 香叶菖蒲
Ａｃｏｒｕｓ ｃａｌａｍｕｓ Ｌ．
过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）同工酶作为一种重要的 遗传标记被广泛应用于生物学研究的各个领域，ＰＯＤ 同工 酶能够在很大程度上反映植物个体之间的遗传差异，是探 测基因差异和遗传变异的一种重要手段［１－３］。ＰＯＤ 同工酶作为 遗传标记，可为农作物、药用植物与药材品种鉴定提供重要 依据［１－３］。传统的 ＰＯＤ 同工酶检测方法是先用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（ＰＡＧＥ）分离蛋白质样品，再用醋酸联苯胺染色检测 ＰＯＤ 同工酶。笔者建立了 １ 种检测 ＰＯＤ 同工酶的新方法， 基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ） 分离样品，ＳＤＳ 使 ＰＯＤ 同工酶暂时变性，电泳完毕后，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ!１００ 使 ＰＯＤ 同工酶复性，最后用醋酸联苯胺染色检测ＰＯＤ 同工酶；并利用新建立的方法分析了 ５ 种菖蒲属植物叶子的 ＰＯＤ 同工酶，旨在为菖蒲的科学分类和鉴定提供新的生化 指标。 １ 材料与方法 １．１ 材料 ５ 种菖蒲属植物均采自西南交通大学药学院药 用植物园，由西南交通大学药学院宋良科教授鉴定分别为 藏菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｃａｌａｍｕｓ Ｌ．）、香叶菖蒲（（Ａｃｏｒｕｓ ｘｉｎｇｙｅｕｓ Ｚ． Ｙ．Ｚｈ）、石菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｔａｔａｒｉｎｏｗｉｉ Ｓｃｈｏｔｔ）、金钱菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓ Ｓｏｌａｎｄ．）和宽叶菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉｕｓ Ｚ．Ｙ．Ｚｈ）。
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
分离过氧化物同工酶
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶 蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同 工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的 遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一 定关系，因此作为基因表达的产物，测定同 工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具， 在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有 重要的意义。
4、电泳 加样，连接电极线，电泳。 5、剥胶，染色，记录结果
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联 剂N，N‘-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚 合而成的 聚合:化学法—过硫酸铵-TEMED 光化学法—核黄素-TEMED 光聚合形成的凝胶孔径较大 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决 定
2、分别制备分离胶、浓缩胶
在玻璃板做记号，取专用小烧杯，按分离胶取样表加试剂，混匀后沿长玻 璃板小心加到玻璃板之间（避免产生气泡），加至记号处，立即覆盖 2～3mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面出现时表 明胶已聚合。按浓缩胶取样表加试剂，倒掉分离胶上的水层，立即加入 浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀 释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品 槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
■ 凝胶的聚合：
聚合反应
free radical
Bis Bis
顶点自由基 可再延续
自由基形成
催化系统
聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化 诱发剂系统产生自由基 化学聚合 过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺） 孔径较小，用于制备分离胶 影响聚合：低pH，氧分子，一些金属离子，低温 光聚合 核黄素—TEMED 需要有痕量氧存在 ，直接日光或室内强散射光 孔径较大，用于制备浓缩胶胶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比： a:b<10 脆硬乳白交联度： a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
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医学ppt
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五、结果与分析
结果 电泳图或模式图
分析 过氧化物同工酶的医学种ppt 类及活力大小 21
六、讨论与心得
实验注意事项 心得收获
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反应过程
TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
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Bis将单体长链间连成网状结构：
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PAGE法分离蛋白质的三种效应
电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在 同一电场中泳动率不同；
分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同， 在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各 不相同，泳动率也不相同；
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三、材料、仪-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
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1.电泳概念
电泳：带电粒子在电场中向与其电性 相反的电极移动的现象。
—
○+
○-
+
○-
○+
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（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
2.电泳分类
显微电泳
自由界面电泳
区带电泳
– 纸电泳
– 醋酸薄膜电泳
– 琼脂糖凝胶电泳
– 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
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5
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过 硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺 凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
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四、操作步骤
装槽、上样
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30-50μL
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四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
实验五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）分析
（P98）
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一、目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术 的原理和操作方法
掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理 和方法
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二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色
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（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） P20
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，
测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某
一时期植物体内代谢的变化。
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（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、 电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个 极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条 带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）
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（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的 分子结构及其理化性质不同的一组酶。
3.电泳法原理
在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的 电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：
颗粒性质：
– 净电荷数目 – 颗粒大小 – 颗粒形状
电场强度：V/cm 溶液性质：
– 缓冲液的pH – 离子强度 – 溶液黏度 – 电渗：液体对固体支持物的相对移动
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（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
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四、操作步骤
凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
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四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物 酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方 法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化 物酶同工酶。
H2O2
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶 +H2O+联D苯胺
棕色物质
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三、材料、仪器和试剂
材料：小麦幼苗
仪器：电泳仪、 电泳槽、高速离 心机、量筒、烧 杯、微量注射器、 研钵、染色盒
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
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四、操作步骤
剥胶、染色
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取 下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地 将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染 色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。