动物重要病原菌功能基因组与分子致病机理研究

项目名称：动物重要病原菌功能基因组与分子致病机理研究首席科学家：周锐华中农业大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部湖北省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题1．病原菌在动物和人中的流行与传播机制结核病是全球死亡人数最高的人类传染病，主要由结核分枝杆菌引起，但在发展中国家，牛结核是人结核的重要传染源，10％的人结核是由牛结核引起的。

牛结核主要由牛分枝杆菌引起，但国内外关于牛感染人结核的证据越来越多。

在上一个973计划项目中我们发现，我国分菌证实的牛结核中，46％为人结核分枝杆菌，54％为牛分枝杆菌；牛结核呈上升蔓延趋势，但我国结核分枝杆菌复合群在牛和人间的相互传播尚缺乏系统研究。

猪链球菌有33个血清型，除在动物间流行外，1型、2型、4型、14型和16型对人致病，是致成人脑膜脑炎的重要病原菌之一。

前期研究证实，除2型外的其它血清型有增加趋势。

副猪嗜血杆菌虽然未见感染人的报道，但它是当前危害世界养猪业最重要的病原菌之一，其血清型和致病性的多样性是兽医临床诊断与防控的最大挑战。

因此，结核和猪链球菌在动物和人中的流行与传播规律、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型和致病性的动态变化、病原菌毒力多样性和抗原多样性的遗传基础等，是本项目拟解决的关键科学问题之一。

2．病原菌的蛋白质互作与基因调控网络在后基因组时代，生命科学领域的研究人员面临的问题不再仅仅是某个基因、某个蛋白质等单个分子的功能，而是由分子之间相互作用形成的极其复杂的调控网络，从系统生物学的角度认识生命活动规律。

结核分枝杆菌和猪链球菌是两种重要的人兽共患病原菌，研究病原菌蛋白质－蛋白质相互作用网络与基因调控网络是理解其基因和蛋白质网络结构及功能的基础和关键，继而理解病原菌的生长、代谢、毒力调控、致病机制、耐药机制等重要科学问题，并为病原菌防治提供新的药物靶标和策略。

3．病原菌的致病与免疫逃避的机制传染病的发生、发展与转归是病原微生物与宿主相互作用的结果，不同病原菌有其特殊的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制。

结核分枝杆菌引起低烧及长期的慢性炎症反应，猪链球菌感染则引起急性炎症反应，致死率非常高，而副猪嗜血杆菌感染则主要引起亚急性炎症反应。

因此，这三种病原菌是研究细菌感染过程中炎症反应的作用及机制的良好模型。

结核分枝杆菌是一种特殊的胞内寄生菌，其免疫逃避及引起慢性炎症的分子机制在动物个体、细胞及分子水平都已做了大量研究，但仍没有完全解释清楚，迫切需要更加深入的研究。

猪链球菌和副猪嗜血杆菌分别作为动物新发的革兰氏阳性和阴性胞外菌的代表，均能引起脑膜炎、关节炎和肺炎，其感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制也是急需深入研究的重要基础科学问题。

（二）主要研究内容以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌等重要动物病原菌为研究对象，综合运用分子流行病学、现代细菌学、分子免疫学、功能基因组学、蛋白质组学、糖组学等研究手段，开展如下研究：进一步开展牛结核、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的病原学与流行病学研究，建立菌种资源库，深入研究结核分枝杆菌复合群在牛和人中的流行现状与传播规律、猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型及致病性的动态变化、病原菌毒力多样性和抗原多样性的遗传基础。

完善已构建的结核分枝杆菌全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，构建猪链球菌的全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，发掘与细菌生长、代谢、毒力调控和耐药相关的新关键因子和药物靶标。

以结核分枝杆菌、猪链球菌等病原菌为研究对象，进行细菌糖组学研究，从多糖的生物合成、结构及功能三个层面入手，阐明结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖的合成途径和生物学作用，深化对这两种病原菌的生长及感染机制的认识，为抗菌药物开发新策略提供理论基础。

研究人结核分枝杆菌对牛的致病性，鉴定牛分枝杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的新的毒力因子，深入研究病原菌毒力因子与宿主细胞的相互作用及其信号传导途径，研究猪链球菌与副猪嗜血杆菌的协同致病作用及其机制。

研究结核病发生、发展和转归过程中炎性因子的变化及其调控机制，牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制，猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。

二、预期目标（一）总体目标以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌为研究对象，初步阐明结核在牛和人中的流行特征与传播规律，猪链球菌和副猪嗜血杆菌优势血清型和致病性的动态变化，揭示病原菌基因组序列的变异、毒力多样性和抗原多样性的遗传基础；解析病原菌的蛋白质相互作用与基因调控网络，及表面多糖的结构、合成机制与功能，阐明病原菌的生长、代谢、毒力调控、DNA损伤修复与耐药机制，发掘新的功能基因、蛋白质和表面多糖；研究病原菌及其蛋白质和表面多糖与宿主的相互作用及其信号传导途径，初步阐明病原菌的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。

（二）五年预期目标1．揭示结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌在动物中的流行规律与生态分布，阐明优势血清型和变异株与致病性间的关系，重点探讨结核分枝杆菌复合群在牛和人间流行的传播机制，为这三大疾病的防控提供理论依据。

2．分离鉴定和收集分枝杆菌500株，其中牛源结核分枝杆菌200株（人型及牛型）、猪链球菌和副猪嗜血杆菌2000株，建立基因组多态性数据库和基因组多态性研究的技术平台，阐明主要流行株的基因组序列变异和进化规律。

3．完善和构建结核分枝杆菌和猪链球菌的蛋白质相互作用网络和转录调控网络，初步阐明细菌生长、代谢和毒力调控的分子机制，揭示结核分枝杆菌DNA损伤修复与耐药之间的关系。

4．鉴定牛分枝杆菌的乙酰化蛋白谱及Sir2蛋白的底物蛋白谱，揭示Sir2蛋白与牛分枝杆菌致病性及药物作用机理之间的关联性。

5．鉴定结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖及结核分枝杆菌细胞壁多糖的生物合成途径中的糖基供体合成酶基因和糖基转移酶基因，完成10种糖基供体合成酶和糖基转移酶基因的克隆及表达，并确定其在病原菌表面多糖生物合成途径中的功能；完成5种糖基转移酶基因对病原菌生长及感染影响的分析；解析1-2种重要表面多糖的组分和结构，明确其在细菌生长及致病中的关键作用。

6．初步阐明人结核分枝杆菌对牛的致病特征；鉴定猪链球菌、副猪嗜血杆菌及结核分枝杆菌的新的毒力相关基因20个以上，完成8－10个毒力因子与宿主细胞的相互作用及其信号传导通路研究，初步阐明猪链球菌与副猪嗜血杆菌的协同致病作用和机制。

7．鉴定结核病发生、发展与转归过程的分子标识；初步阐明自噬在牛分枝杆菌感染的先天性免疫和获得性免疫中的作用及其机制，揭示牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制；阐明猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。

8．发表SCI收录论文50－60篇，申请/获得专利15－20项，培养5－6名左右中青年学术骨干，培养研究生100－150名。

三、研究方案（一）总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性分析1．总体研究思路结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌是严重危害畜牧业健康发展和人民健康的重要病原菌，其血清型或基因型复杂；结核分枝杆菌复合群和猪链球菌的宿主谱广，可在人和动物间相互传播，但其传播链和传播机制尚不清楚；三种病原菌常与其它病原微生物混合感染和继发感染，形成复杂的病原生态学关系，其单独致病和协同致病的机制，病原菌诱导宿主的先天性和获得性免疫反应，以及病原菌免疫逃避和持续感染的机制等，都是动物细菌性传染病研究领域复杂和关键的科学命题。

本项目从病原菌的分离鉴定和收集及流行规律、生态分布和基因组序列变异等研究入手，揭示病原菌的流行与传播机制、流行血清型和致病性的动态变化及毒力多样性和抗原多样性的遗传基础；进而以代表性的菌株为研究对象，构建病原菌的蛋白质互作与基因调控网络，研究病原菌表面多糖的合成机制与功能，揭示病原菌生长、代谢、毒力调控和耐药机制，预测和鉴定新的功能基因、蛋白质和表面多糖；深入研究病原菌及其蛋白质和表面多糖与宿主的相互作用，揭示病原菌的感染、致病、免疫应答和免疫逃避的机制，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。

2．技术路线代病菌株分离血清型基因组序糖基供体合成酶胞壁多糖和功能基因与宿主相互生长调控，人结核分枝结核病发生发展牛分枝杆表菌株(一) 原菌在动物和人中的流行和传播机制鉴定/基因型耐药性流行环节与溯源列变异分析ORF 组的克隆及蛋白质互作与基因调控网络构建DNA 代谢相关蛋白相互作用亚网络解析（二）蛋白质互作与基因调控网络（三）胞外多糖的结构与功能（四）感染与分子致病机制（五）免疫应答与免疫逃避机制和糖基转移酶基因的克隆与功能研究表面多糖的结构与功能研究和蛋白质胞外多糖作用及信号传导通路DNA 复制与损伤修复及耐药机制新药靶标杆菌对牛的致病性猪链球菌与副猪嗜血杆菌协同致病机制和转归中炎性因子变化及调控菌的免疫逃避机制猪链球菌诱导炎症紊乱机制3．可行性分析工作基础：本项目是在2010年结题验收的973计划重大传染病基础研究专题“重要动物病原菌的分子生物学与致病机理研究”（2006-2010）的基础上滚动申报的。

已结题的973计划项目在科学研究、人才培养、平台建设、重要成果等方面均超额完成了计划任务，并被评为“优秀”。

本项目研究仍然以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌为主要研究对象，拟解决的关键科学问题是在上一个项目研究的基础上提炼出来的，研究内容是上一个项目的延续和深入，申报单位和主要学术骨干均参与了上一个973计划项目的研究，并取得重要研究成果。

因此，本项目有非常坚实的工作基础。

人才队伍：本项目的研究队伍来自教育部属大学、中科院和中国农科院等优势单位，结构合理，年富力强，专业特长突出，学科交叉。

项目组绝大多数人员参与了上一个973计划项目的研究，具有良好的团队合作基础和前期研究工作基础。

本次又吸纳了新的技术骨干，加强分子流行病学和免疫机理的研究。

因此，本项目有优秀的人才队伍保障。

技术平台：本项目涉及的关键研究技术平台，包括分子流行病学、基因组学、蛋白质组学、细菌多糖的合成途径与功能分析、相关病原菌的遗传操作体系、分子免疫学、基因蛋白质相互作用、病原与宿主细胞的相互作用、相关疾病的动物模型等均已建立，并能熟练运用。

支撑条件：本项目涉及的七个单位拥有与该申请项目研究领域相关的4个国家重点实验室、3个省部级重点实验室和1个中科院重点实验室；四家单位拥有资质认可、运行良好的生物安全III级实验室。

因此，本项目有良好的硬件条件保障。

（二）项目的创新点与特色1．在我国，结核病在动物（特别是牛）和人间相互传播有增加的趋势，猪链球菌不仅在动物中感染率高，而且已成为成人脑膜脑炎的重要病原菌之一，副猪嗜血杆菌病是养猪业最重要的新发细菌性传染病。