实验六 阿司匹林原料药中水杨酸的液相色谱分析测定
高效液相色谱法同时测定复方阿司匹林片中各种有效成分及游离水杨酸
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ａｓｐｉｒｉｎ （Ａ）， ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎｅ （Ｐ） ａｎｄ ｃａｆｆｅｉｎｅ （Ｃ） ｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｓｐｉｒｉｎ ｔａｂｌｅｔｓ ｂｙ ＨＰＬＣ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｏｎ ａ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ （Ｃ１８， ＶＰ－ＯＤＳ １５０Ｌｘ４．６） ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ （Ｖ／Ｖ ＝ ４６：５２：１．５：０．５） ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ （υ＝０．８ｍＬ／ｍｉｎ） ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２７９ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ Ｙ＝１４１５．５Ｘ ＋ １１２７８ （ｒ＝０．９９９８） ｆｏｒ Ａ （０．２７￣８０．２７μｇ．ｍＬ－１）， Ｙ＝１７３０．８Ｘ ＋ ６２４．７ （ｒ＝０．９９９６） ｆｏｒ Ｐ （０．１９￣５７．３４μｇ．ｍＬ－１）， ａｎｄ Ｙ＝６５６．２Ｘ ＋ ６６３５．２ （ｒ＝０．９９９６） ｆｏｒ Ｃ （０．０４￣１２．３９μｇ．ｍＬ－１）． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｗｅｒｅ ９９．８４％ ｆｏｒ Ａ， １００．２９％ ｆｏｒ Ｐ ａｎｄ １００．５７％ ｆｏｒ Ｃ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｌｏｗｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ＡＰＣ ｔａｂｌｅｔｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｓｐｉｒｉｎ ｔａｂｌｅｔ， Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ａｓｐｉｒｉｎ， Ｃａｆｆｅｉｎｅ， Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎｅ， Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ
阿司匹林药物的高效液相色谱法测定
实验四阿司匹林药物的高效液相色谱法测定[目的要求]1、了解高效液相色谱法分离有机化合物的基本原理及操作条件；2、掌握高效液相色谱仪的基本结构及作用；3、了解HPLC法测定阿司匹林药片中水杨酸的方法。
[基本原理]高效液相色谱法是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。
液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。
在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论基础，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。
这种柱色谱技术称做高效液相色谱法。
它可用来作液固吸附，液液分配，离子交换和空间排阻色谱（即凝胶渗透色谱）分析，应用非常广泛。
据估计，世界上几百万种化合物中除20%宜用气相色谱(GC) 分离分析外，其余80%的化合物，包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC ( 正相HPLC、反相HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等等) 进行分离分析。
而且高效液相色谱法还具有以下几个突出的特点：（1）分离效能高由于新型高效微粒固体相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达5000~30000块/m理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱的1000块/m 理论塔板数的柱效；（2）选择性高由于液相色谱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性，因此高效液相色谱不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体；（3）检测灵敏度高高效液相色谱法使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度，紫外检测器灵敏度可达10-9g，荧光检测器灵敏度可达10-12g；（4）分析速度快由于高压泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱法其分析时间大大缩短。
高效液相色谱仪器系统的主要部件:储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置（色谱工作站）：(1) 输液系统输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。
GC-MS测定阿司匹林中的水杨酸
生物制药与研究2018·01170Chenmical Intermediate当代化工研究GC-MS 测定阿司匹林中的水杨酸＊詹佶睿 朱致君 高仕君 郭天童（武汉大学化学与分子科学学院 湖北 430000）摘要：本实验旨在运用气相色谱-离子阱质谱的SIM定量方法，调整色谱柱参数，通过BSTFA这种具有较高活性的衍生试剂，对阿司匹林片中的成分水杨酸进行衍生作用，弥补水杨酸直接用GC-MS测定的存在的灵敏度低、峰展宽较大等不足，从而提高测定的灵敏度，并绘制出工作曲线，探究在特定条件下的灵敏度和重现性问题，结果表明：水杨酸在44-88μg/mL范围内线性关系良好，方法具有操作简便、无需净化步骤、准确度高、重现性好等特点，可用于阿司匹林药片中的水杨酸的测定。
关键词：水杨酸；气相色谱-质谱联用；衍生；BSTFA中图分类号：R 文献标识码：ADetermination of Salicylic Acid in Aspirin by GC-MSZhan Jirui, Zhu Zhijun, Gao Shijun, Guo Tiantong(Chemistry and Molecular Science College of Wuhan University, Hubei, 430000)Abstract ：The purpose of this experiment is to use SIM quantitative method of gas chromatography-ion trap mass spectrometry to adjust theparameters of the column, to derive the salicylic acid from aspirin tablets through derivative reagent with higher activity such as BSTF A to make up for salicylic acid GC-MS directly with the existence of the low sensitivity, peak broadening and other deficiencies,thereby increasing the sensitivity of the determination and draw the working curve to explore the sensitivity under certain conditions, and reproducibility, the results show that:salicylic acid The linearity in the range of 44-88 ug / mL, the method has the advantages of simple operation no purification steps, high accuracy, good reproducibilityetc., can be used for the determination of salicylic acid in aspirin tablets.Key words ：salicylic acid ；gas chromatography-mass spectrometry ；derivatization ；BSTF A阿司匹林（乙酰水杨酸）是水杨酸类非甾体抗炎药，是常用的解热、消炎镇痛药。
高效液相色谱法测定复方阿司匹林中有效成分
高效液相色谱法测定复方阿司匹林中有效成分
用超纯水稀至lOOOmL摇匀。
4、液相色谱分离条件：G&色谱柱；流动相：甲醇：1%冰穂酸溶液(50: 50); 流速：1.0
ml/min；检测波长：276 nm；柱温：30°C o
5、标准曲线制作：将浓度分别为25、5()、125、250j.ig/mL阿司匹林标准溶液，进样
2()pL,二次进样，以浓度C(Mg/mL)对应二次测定峰面积平均值A制作工作曲线，并进行回归分析，得回归方程。
6、样品测定：将样品溶液用0.45pm的微孔滤膜过滤，进样20P L,分别进样二次，用回归
方程计算阿司匹林肠溶片中阿司匹林含量。
五、数据记录及处理
1•数据记录
C(ppm)Ai A2A平均
000
25177165.4171.2
50325.9328.6327.25
125796.9803.1800
250160&11609.91609
c样品672.1665.7668.9
2.标准曲线的绘制:
根据上表数据，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A平均)为纵坐标作图，得到标准曲线如下图：
阿司匹林标准曲线
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合!。
阿司匹林中乙酰水杨酸含量的测定
阿司匹林中乙酰水杨酸含量的测定阿司匹林是一种常见的非处方药，广泛用于缓解小至中度疼痛以及减轻发热等症状。
其主要成分是乙酰水杨酸，可通过化学方法来测定其含量。
一、实验原理乙酰水杨酸为无色或白色结晶性粉末，是一种有机酸。
它可以在碱性条件下水解成水杨酸和乙酸，而水杨酸可以与铁离子反应形成红色络合物。
利用此原理，可以使用一种称为铁氰化钾法的方法来测定乙酰水杨酸的含量。
铁氰化钾法的基本原理是：将阿司匹林样品与过量碱液反应，水解成为水杨酸和乙酸。
然后，加入过量的铁氰化钾溶液，水杨酸与铁离子反应产生红色络合物。
通过比较样品红色络合物的吸光度与已知浓度的乙酰水杨酸标准曲线的吸光度来测定乙酰水杨酸的含量。
二、实验步骤1. 制备乙酰水杨酸标准曲线：(1) 准备含不同浓度乙酰水杨酸的标准溶液，用去离子水调制成每毫升1mg/mL的乙酰水杨酸溶液。
(2) 取不同浓度的标准溶液如0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 mL分别加入5.0 mL安乃近溶液中，然后加入5.0 mL氢氧化钠溶液，用去离子水稀释至50.0 mL。
(3) 以铁氰化钾为基础，制备铁氰化钾溶液（50 mg/L），5.0 mL盛于10 mL容量瓶中，用去离子水稀释至10.00 mL。
(4) 用铁氰化钾试剂将样品转化为反应所需的酸性条件，取1.0 mL 25%硝酸加入样品中，用去离子水定容至50 mL，即为铁氰化钾试剂。
(5) 按照铁氰化钾试剂说明书上的取样方法和使用方法制备分别为0.01~0.2 mg/mL的标准浓度溶液，置于离心管中混匀。
(6) 用分光光度计分别测量吸光度，并用已知浓度的乙酰水杨酸标准曲线的吸光度进行比较。
2. 阿司匹林样品的测定(1) 取0.25 g阿司匹林样品，加到50 mL锥形瓶中，加入5.0 mL氢氧化钠溶液，并加盖，摇动混匀。
(2) 放置1小时，过滤，将滤液定容至50 mL。
（若中途出现白色析出物，加入一滴2 mol/L盐酸溶液重新明亮）(3) 用铁氰化钾试剂将样品转化为反应所需的酸性条件，取1.0 mL 25%硝酸加入样品中，用去离子水定容至50 mL，即为铁氰化钾试剂。
[药物分析] 实验6 高效液相色谱法用于阿司匹林肠溶片中游离水杨酸检查和阿司匹林含量测定
![[药物分析] 实验6 高效液相色谱法用于阿司匹林肠溶片中游离水杨酸检查和阿司匹林含量测定](https://img.taocdn.com/s3/m/7a906d70b9d528ea80c779d5.png)
【思考题】1.供试品溶液制备中，为什么要选用1%冰醋酸甲醇溶液作为溶剂？为什么供试品溶液需要临用新制？为什么供试品溶液需要过滤，取续滤液使用？除滤膜过滤外，还有什么方法可以达到同样的目的？①防止阿司匹林水解。
②由于供试品溶液室温下不稳定, 因此需要临用新制。
③过滤是为了除去其中的不溶性辅料等杂质。
续滤液指过滤时去掉前几滴后的滤液，可以保证待测药物的浓度与均一度。
前面的部分溶液需要对滤膜润洗，因而影响了药物的浓度，最终影响峰面积或峰高。
④………………2.为什么流动相需要过滤和超声波脱气？过滤是为了除去流动相中的杂质，保护系统和柱子。
主要是过滤掉不溶性微粒和气体，（尤其是有机相和水相混合的时候，会产生大量的气泡），防止堵住仪器和色谱柱。
脱气是为了除去溶解在流动相中的气泡。
防止气泡影响色谱柱的分离效率、检测器的灵敏度、基线的稳定性。
此外，溶解在流动相中的氧可以与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）发生反应。
溶解气体也会引起溶剂pH值的变化，从而导致分离或分析结果的误差。
3.系统适用性试验的目的是什么？系统适应性试验参数和合格标准是建立基础是：仪器，电子元件，分析操作和待测样品是个不可分割的整体。
系统适应性实验确保系统在样品分析的时候能很好地运行。
在分析方法中应当要包括适当的系统适应性合格标准。
按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
色谱分析做系统适用性试验主要是为了确定分析使用的色谱系统是有效的、适用的。
系统适用性通常用四个参数来确定系统的适用性：分离度，柱效，重复性和拖尾因子。
其中分离度和柱效是两个最重要，也更具有实用意义的参数。
分离度是判断两物质在一个方法中分离的程度，虽然与柱效相关，但在衡量系统适用性时，强调的应该是分离度，只有当色谱图中仅有一个色谱峰或测定微量成分时，规定柱效才有其特殊重要性。
关于阿司匹林中乙酰水杨酸含量测定实验的讨论
（1）0.1000 mol·L HC1溶液的配制和标定
（2）NaOH标准溶液与HC1标准溶液体积比的测定
（3）药片中乙酰水杨酸含量的测定
准确称取0.6g左右(
0．8g／片)药片研成的粉末于100ml的烧杯中，用移液管准确加入25.0 ml 1.00mol/LI1NaOH标准溶液，加蒸馏水30 m1，轻摇几下，水浴加热15 min，迅速用流水冷却，并定量转移至100ml容量瓶中，稀释至刻度、摇匀。
用移液管准确移取10ml溶液于250ml锥形瓶中，加水20—30ml，滴加2滴酚酞，用浓度约为0.1000 mol/L HC1标准溶液滴至红色消失即为终点．
存在的问题
问题一：
淀粉为胶状沉淀，比较难过滤。与此同时，过滤过程中会造成较大损失。因此课上我们采取的是不过滤的做法。
问题二：
不过滤在用移液管移取溶液时会因混如淀粉而是溶液体积偏小。
A．P．
C．及水杨酸的最大吸收波长有重叠．从而难以准确测定水杨酸含量。图中曲线2,λ
229处为
A．，λ
250处为P．，λ
275处为
C．，λ
295-330处为水扬酸．从图中看，在25O～330nm波长范围内无特征峰，因而不能进行水杨酸的定量测定。本实验利用水杨酸与Fe能形成紫堇色配合物的原理，在可见光区(520nm)测定水杨酸含量，
在用移液管移取溶液时，由于100ml容量瓶体积较小，因此很难避免将瓶底的淀粉吸取上来。另外，由于仅移取10.00ml溶液，淀粉所占体积分数是比较大的，因此会造成较大误差。
改进方案：
第一种：冷却后在溶液中加入α-粉酶至淀粉全部溶解。以下同原操作。
优点：
淀粉全部被α-淀粉酶溶解，最终产物以麦芽糖和葡萄糖为主，不但解除了淀粉胶状沉淀对实验的干扰，而且新的生成物对实验结果也没有什么影响。
阿司匹林中乙酰水杨酸和水杨酸含量的测定(正式)
六、思考讨论
1．在找寻双波长时，我们首先根据水杨酸和阿司匹林标准品的光谱图形寻找。光谱图中277.5nm处阿司匹林处于最大吸收。图中320nm处的水杨酸的吸光度值与277.5nm处的吸光度值相等。利用紫外分光光度计的光度测量时，发现有误差。在318.5nm处的水杨酸吸收值与277.5nm处的相同。我们首先用318.5nm、277.5nm作为双波长的两个波长值。测出的样品的含量大于100%，引起了我们队实验的正确操作性的怀疑。于是我们重新走了水杨酸的光谱，找出2个波长为277.5nm和320nm。在这个条件下，我们再次测量了标准品、样品的吸光度，并算出样品的含量仍然大于100%。经老师讲解，工厂做工有一定误差。标示量为40mg/片，但含量也许更多。
三、仪器和试剂
1.仪器 UV-2550紫外-可见分光光度计、容量瓶10ml、50ml。
2.水杨酸标准品1.008mg/ml、阿司匹林标准品1.008mg/ml、阿司匹林样品40mg/片、乙醇。
四、实验步骤
1.样品溶液、标准溶液的配置：
标准溶液的配置：取6个10ml容量瓶，标号1~6。使用微量进样器精密吸取阿司匹林标准品0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml注入各个容量瓶，95%乙醇定容。配置成约40μl/ml、60μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、120μl/ml的标准溶液，备用。并将水杨酸标准品溶液稀释为20μl/ml，备用。
0.4188
C
40.24
60.36
80.48
100.6
120.72
x
2．标准曲线（△A-C关系图）
第一次测量
第二次测量
3．利用第一次测量得出的曲线，根据样品的吸光度值，在标准曲线上找到相应的浓度94.37μl/ml。
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实验六阿司匹林原料药中水杨酸的液相色谱分析测定
一、实验目的
1. 掌握高效液相色谱定性、定量的原理及方法。
2. 了解高效液相色谱仪的结构和操作。
3. 了解高效液相色谱一般实验条件。
二、实验原理
1.高效液相色谱分离的基本原理
分析试样中各组分在流动相推动下，通过装有固定相的色谱柱到达检测器。
由于不同化合物分子结构和物理化学性质不同，与固定相及流动相的作用力不同，在两相中具有不同的分配系数，各组分在两相中进行反复分配而被分离。
在同一色谱条件下，标准物质与待测样品中同一化合物保留时间一致是色谱法定性的基本依据。
定量分析首先要选择合适的色谱柱和洗脱液系统及对被分析物反应较为灵敏的检测器。
被测组分要与其他成分有足够的分离度。
一般要求被定量的物质与相邻组分的分辨率要大于1.5，分辨率R s用下式计算：
2（t R2-t R1）
R s= ——————
ω1+ω2
式中：t R2-t R1为两个组分的保留时间之差；ω1、ω2为两个谱带基线宽度。
当R s≥1时，峰面积重叠小于2%，定量结果比较准确。
2.外标校正曲线法定量
校正曲线是通过测定一系列已知浓度的标准样品，经曲线拟合而得到的含量-响应值（峰面积或峰高）的曲线。
测定待分析样品的响应值后，用校正曲线进行含量计算的方法为外标法。
3.水杨酸含量分析
阿司匹林（乙酰水杨酸）为常用的解热镇痛药，并被用于防治心脑血管病。
由于其很容易降解为水杨酸，药物中水杨酸含量测定被用于阿司匹林的质量监测。
用液相色谱法可以很好地分离阿司匹林和水杨酸，水杨酸的含量可用外标法进行定量测定。
三、仪器与试剂
1.高效液相色谱仪（包括高压输液泵、进样阀及紫外检测器）
固定相：C18键合多孔硅胶小球，5μm。
柱尺寸：150mm×4.6mm I.D.。
20μL定量环。
2.试剂
双蒸水；甲醇（色谱纯）；冰醋酸（分析纯）；水杨酸（标准品）；乙酰水杨酸（阿司匹林）（原料药品）。
四、实验步骤
1.标准溶液及样品溶液的配制
（1）水杨酸标准溶液的配制
称取水杨酸标准品8.1mg，溶解后，转移至1000mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为水杨酸储备液。
分别吸取此储备液1.00mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL于10 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
（2）阿司匹林样品溶液配制
称取阿司匹林原料药10mg，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为阿司匹林样品储备液。
吸取此储备液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
2.色谱分析
（1）色谱条件
检测波长：300nm。
流动相：甲醇-水-冰醋酸（体积比60:40:4）
流速：1 mL∕min。
温度：室温。
（2）操作程序
当基线温度后通过进样阀进行水杨酸标准溶液色谱分析，用数据处理系统绘制标准曲线。
标准曲线的相关系数应为0.998以上。
进行阿司匹林样品溶液色谱分析，用外标法计算样品中水杨酸含量。
五、实验数据及结果
利用色谱工作站软件，按外标校正曲线法计算阿司匹林中水杨酸的质量分数。
1.用数据处理系统绘制标准曲线
在“method”文件中选择外标法（ESTD）。
在菜单中选择“data analysis”，用“load signal”调出最低浓度的水杨酸标准样品数据文件。
从“calibration”中选择“new calibration table”，并在显示的窗口中输入“1”作为校正级数（level），在“calibration table”中填入样品浓度值。
一个校正水平为一个浓度校正点。
用“load signal”依次调出其他浓度的水杨酸标准样品数据文件，同时用“add level”输入其他校正点的校正级数（level）和样品浓度值数据。
所得到的校正曲线及相关系数自动显示与右侧窗口。
2.计算阿司匹林样品中水杨酸的含量
用“load signal”打开阿司匹林样品数据文件，数据处理系统自动根据校正曲线计算出阿司匹林样品溶液中水杨酸的含量（注意：在建立标准曲线时若输入浓度单位为μg∕mL，所得到的浓度单位仍为μg∕mL，在下面的计算中要转换为mg∕mL）。
根据下式计算阿司匹林原料药中水杨酸的含量：
水杨酸的含量（%）=（c×10×100∕m）×100
式中：c为阿司匹林样品溶液中水杨酸浓度（mg∕mL）；m为阿司匹林原料药称量质量（mg）。
六、注意事项
（1）实验步骤按照Agilent 1100液相色谱仪器具体操作方法写
成，不同的色谱仪在操作指令上会有所不同。
（2）实验条件（主要是流动相配比）可以根据实际情况进行调整。
（3）实验结束后，以甲醇-水（体积比60:40）为流动相冲色谱柱约30min。
七、思考题
1、使用C18色谱柱时，如果采用甲醇-水（体积比50：:50）作为流动
相，求该流动相的强度因子。
如果改用乙腈-水作为流动相，若保持相同的强度因子，其体积比应为多少？
2、在其他HPLC色谱条件不变，仅改变下列一种条件，色谱峰的保留时
间与峰形将发生怎样的变化？
（a）流动相流速增加；
（b）柱温升高；
（c）色谱柱增长；
（d）固定相粒径变大；
（e）在线性范围内增大进样量
3、什么是化学键合固定相？有何优点？。