65-人巨细胞病毒核酸检测标准操作程序
人类巨细胞病毒IgG
湖南省职业病防治院作业指导书标题：人类巨细胞病毒病毒（IgG）（酶联免疫法）修改记录湖南省职业病防治院作业指导书文件编号：标题：人类巨细胞病毒IgG（酶联免疫法）版号：第 1 版页码1/21、目的用于检测人体血清或血浆人类巨细胞病毒（IgG）.2、范围利用酶联免疫间接法原理（ELISA）定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG 抗体，适用于人类巨细胞病毒病毒感染的辅助诊断。
3、职责检测人员按照本规程进行检测操作。
4、原理采用酶联免疫间接法原理定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG抗体（HCMV-IgG），以纯化人类巨细胞病毒抗原包被酶联板。
待检血清中的人类巨细胞病毒与包被抗原反应，再与酶标记鼠抗人IgG抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。
加底物TMB显色，在酶标仪上比色后根据吸光度（A值）判定有无人类巨细胞病毒IgG抗体的存在。
5、样本要求5.1仅限于检测人体血清或血浆。
5.2常规方法采集。
5.3血清：采血后，室温放置1-2小时，待血液凝固，再于3000转/分钟离心15分钟。
5.4血浆：采血后，样品与抗凝剂反复轻摇混匀，再3000转/分钟离心15分钟。
5.5如果样品没有在8小时内测定，应将其保存于2℃-8℃。
如果样品不能在7天内测定，应将血清或血浆与血细胞分离， -20℃保存，避免反复冻融。
6．分析系统6.1分析仪器：Thermo Mk3型酶标仪，检测波长450nm，参考波长630nm。
6.2 37℃恒温箱。
6.3 振荡器用于样品、试剂的混匀。
6.4 微量加样枪。
6.5 试剂准备：试剂盒于冰箱保存，使用前应取出置37℃。
取试剂盒内洗涤液用蒸馏水作25倍稀释，置洗瓶中备用。
6.6 质控试剂：-20℃保存，溶解后随试剂一起冷藏，每天随样品一起检测并保存质控结果，每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。
7、分析步骤7.1 样品编号：从5号开始编号。
7.2设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各100微升。
ELISA法检测巨细胞病毒CMV抗体测定(CMV-IgM)标准操作程序
1.检测原理采用酶联免疫捕获法原理进行检测。
利用抗人IgM单克隆抗体制备包被板，辣根过氧化物酶标记CMV 抗原制备酶结合物。
通过免疫反应形成固相二抗-抗体-抗原-酶复合物，该复合物催化底物显色，显色强度与CMV-IgM抗体含量成正比。
2. 样本类型及处理方法3.试剂注意事项：开启所有试剂（包括校准品、标准品、质控品）需注明日期及签名。
每个试剂容器都需贴上写有以下内容的标签：启用日期、截止日期。
开启时应检查试剂是否变色，是否肉眼可见的细菌生长迹象、浊度、沉淀反应等，这些表示试剂已经变质或超过保质期。
不同批号试剂盒中各组份不可以互换，组份所标示量为最低分装量。
4.仪器设备备注：“溯源方式”栏填写送较、自校、送检、自检、比对等。
5.质量控制5.1使用的质控品5.2质控周期5.2.1每一批次标本均需运行一次质控。
5.2.2每一批标本最大量为：92个标本。
5.3变异系数CV<20%5.4质控判断标准即时质控法5.5失控处理：对质控失控需查找原因并进行分析5.5.1先观察整块酶标板显色是否正常。
5.5.2查找操作过程是否按照SOP文件进行。
5.5.3质控品S/CO值>3SD或质控品S/CO值<3SD，结合模式报告结果。
6.操作步骤6.1选用试剂：郑州安图生物工程股份有限公司6.2平衡：从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应放置室温平衡30分钟后方可使用，余者应及时放入有干燥剂的自封袋封存于冰箱中备用。
在平衡试剂的同时，待测标本需放置室温平衡30分钟后再行测试。
6.3配液：取1包固体洗液用500ml纯化水溶解后备用。
配制好的洗涤液如用不完可放置2-8℃冷藏储存，使用前应放置室温平衡20分钟后方可使用。
6.4加样：用移液器在反应孔中分别加入阴、阳性对照血清和CMV-IgM质控品各100ul，测定孔中加入样品稀释液100ul，再依次加入待测血清样品10ul，用封口膜封板。
巨细胞病毒IgM抗体测定操作规程
巨细胞病毒IgM抗体测定操作规程血清抗巨细胞病毒IgM抗体测定操作规程1、检测目的规范巨细胞病毒IgM抗体的检测实验，以保证检测结果的准确性和重复性。
2、检测方法)检测IgM抗体。
采用酶联免疫吸附法(ELISA3、检测原理采用捕获法原理检测人血清或血浆样品中人类巨细胞病毒IgM抗体(HCMV-IgM)，微孔中预包被鼠抗人-IgM(u链)，首先加入待检标本的血清或血浆样品后，样品中的IgM抗体都可被捕获，未结合的其他成份(包括特异的IgG抗体)将被洗涤除去;第二步，加入酶标记物，酶标记物是辣根过氧化物酶(HRP)标记的基因重组抗原HCMVrp52-65。
被捕获的IgM中的HCMV-IgM会与辣根过氧化物标记的HCMV重组抗原特异性的结合，洗去其他未结合物，最后用TMB底物显色。
通过酶标仪检测吸光度(A值)从而判定样品中HCMV-IgM抗体的存在与否。
4、实验条件(1)实验室应具有空调、离心机、加样水浴锅，酶标仪等设备。
(2)检验人员应经过操作前培训。
(3)用酶标仪测定。
5、操作程序(1)样本采集。
无抗凝静脉血2ml，当日不做的标本4?保存，必要时，-20?冻存。
(2)操作步骤。
参照试剂盒说明书进行操作。
一肌步骤如下:?取出已包被HCMV 抗原的微孔反应条板。
稀释待测血清(血清1ul加稀释液200u1)，加至微孔中，每孔100ul。
将强阳性、弱阳性、阴性对照各100ul加至相应孔内。
?37?温育30分钟;弃去孔内液，每孔加200--300ul洗涤液，共洗5次。
每次弃去孔内液体后均需在滤纸上拍于(下同)。
?每孔加酶标记抗体100ul，37?，30分钟。
洗板同上。
?加酶底物,色原溶液(OPD,TMB)，每孔100ul37?，15分钟。
?加终止液(2mo1,L HSO)，24每孔50ul。
于酶标仪上读取吸光度(A)值。
(3)结果判定:?阴性对照平均A值必须小于0 .2;弱阳性对照平均A值在0 .20,0 .65;弱阳性对照与阴性对照平均A值之比必须大于或等于2。
核酸检测抗原使用方法
核酸检测抗原使用方法
一、采集样本
在进行核酸检测抗原检测前，需要先采集样本。
通常采集鼻咽拭子或口咽拭子，使用一次性拭子在鼻腔或口腔内轻轻旋转擦拭数次，收集粘膜细胞样本。
注意采集时应避免过度擦拭，以免损伤粘膜。
二、样本处理
采集的样本需要进行适当的处理，以释放并提取样本中的病毒核酸。
将采集的样本放入含有细胞保存液的收集管中，充分摇匀后进行离心，以分离出上清液和沉淀物。
将上清液转移至新的收集管中，备用。
三、结果观察
将处理后的样本加入核酸检测试剂盒中，按照说明书要求进行操作。
观察反应结果，通常在15-30分钟内读取结果。
若C和T区域出现两条色带，则为阳性结果，表示样本中存在病毒核酸。
若只有C区域出现一条色带，则为阴性结果，表示样本中未检测到病毒核酸。
若未出现色带或色带模糊不清，则表示检测结果无效，需重新进行检测。
四、垃圾处理
使用完的拭子、废物收集瓶等样本采集工具和已开封或使用后的核酸检测试剂，需按照感染性医疗废物进行处置。
处置时应佩戴一次性手套和口罩，并按照相关规定做好垃圾分类处理工作。
巨细胞病毒IGM抗体测体测定操作规程
巨细胞病毒IGM抗体测体测定操作规程用途：通过检测人血清样本中是否含有巨细胞病毒IGM抗体，用于辅助诊断患者近期感染了巨细胞病毒。
基本原理：本试剂盒采用鼠抗人IGM单克隆抗体包被微孔条，辣根过氧化物酶标记基因工程重组表达的巨细胞病毒特异性原原为示踪物，TMB显示系统，EIA捕获一步法检测人血中抗巨细胞IGM抗体。
试剂：巨细胞病毒IGM抗体检测试剂盒仪器：酶标检测仪样本要求：血清标本按常规方法由静脉采集，血浆标本可采用常规用量的肝素或枸橼酸钠抗凝，5天内测定的标本可以放置4℃保存。
标本放置在-20℃至少可以保存3个月。
标本避免溶血或反复冻溶，混浊或有沉淀的标本应离心或过滤澄清后再检测。
需保存的血清在采集、保存过程中应注意无菌操作。
试验方法：1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用。
2、配液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20稀释备用。
3、设定：每次试验应预设空白对照1孔（暂不加任何液体），阴性对照3孔，阳对照2孔。
4、加样：按顺序在各反应孔中分别加入20υL待检标本和阴、阳性对照。
5、加酶：依次向每孔加入100υL酶结合物（空白对照不加），振荡混匀。
6、温育：在反应板上加盖封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应60分钟。
7、洗板：将孔内液体甩干，在各反应孔加入稀释后的洗涤液300υL，静置15秒钟，甩弃洗涤洗涤液：如此洗涤5遍，最后一次扣干反应板。
8、显色：每孔依次加入底物A、B液务50υL（包括空白对照孔），加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟。
9、终止：每孔加入终止液50υL（包括空白对照孔），振荡混匀终止反应。
10、测定：用空白对照孔调零，并尽快用酶标仪单波长450 nm测定各孔OD值。
也用双波长450nm/630-690nm测定各孔OD值。
结果解释1、临界值（CUT-OFF值）计算：临界值=0.10+阴性对照OD平均值（阴性对照OD平均值≤0. 05按0. 05计算）。
新冠核酸检验操作规程
新冠核酸检验操作规程新冠核酸检验是一种常用的方法来检测新型冠状病毒感染，以下是新冠核酸检验的操作规程。
一、实验室准备工作：1. 确保实验室内有足够的试剂和耗材，包括核酸提取试剂、PCR试剂盒、纯化试剂盒、标本采集和保存耗材等；2. 检查实验室内的设备完好，并及时进行维护和校准；3. 准备好标本接收和处理的工作区域，并保持清洁和消毒。
二、标本采集和处理：1. 选择适当的采集方法和采集器具，如采用鼻咽拭子或喉拭子；2. 采集标本时，确保操作人员戴好一次性手套、口罩和护目镜，并遵循相关的操作规范；3. 将采集的标本放入含有病毒保存液的标本管中，并确保标本管密封良好；4. 标本采集完毕后，及时送至实验室进行处理。
三、核酸提取：1. 根据核酸提取试剂盒的使用说明，准备好提取试剂和相关的试剂盒；2. 根据提取试剂盒的操作规程，将采集的标本转移到提取试剂中，并进行充分混合；3. 按照试剂盒的说明，采用相应的方法进行病毒核酸的提取；4. 注意防止交叉污染和保持操作区域的清洁；5. 提取完成后，将提取得到的核酸样品保存在低温条件下，以备后续的PCR扩增。
四、 PCR扩增：1. 准备好PCR试剂盒和PCR扩增仪，并根据试剂盒的操作说明进行配置；2. 将核酸样品与PCR试剂混合，并进行扩增反应；3. 注意控制扩增反应的条件和时间，以保证扩增效果和准确性；4. 控制反应体系的污染，避免假阳性结果的发生；5. 扩增反应结束后，将反应产物进行凝胶电泳和解读结果。
五、结果分析和报告：1. 根据PCR扩增结果，分析是否存在病毒核酸的阳性；2. 结果分析应根据相关的操作规范和标准进行，确保结果的准确性；3. 对于阳性结果，应及时向相关部门进行报告，并根据相关的防控指南进行流行病学调查和隔离治疗等工作；4. 对于阴性结果，应综合考虑临床表现、流行病学史等因素，综合判断患者是否可能存在感染。
六、实验室安全和质量控制：1. 实验室操作人员应遵守相关的安全规范和操作规程，确保自身和他人的人身安全；2. 实验室应建立和维护质量控制体系，包括正控和负控样品的使用和管理；3. 定期参加质量评估和技术培训，提高实验室的技术水平和质量控制能力；4. 定期对实验室进行清洁和消毒，以保持实验室的清洁和无菌环境。
儿童人巨细胞病毒感染的检测与治疗
儿童人巨细胞病毒感染的检测与治疗郑琦;王大利;李悦【摘要】人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染是我国儿童最常见的感染性疾病之一.作为一类弱致病因子,在健康人群中多呈无症状感染,但在免疫力低下的儿童中则易引发疾病,出现症状性感染,临床以肺炎和肝功能异常较多见.特别是先天性感染HCMV的患儿,多伴有出生缺陷.因此应加大对HCMV感染导致儿童疾病或畸形的重视.该文儿童感染HCMV的现状做简单介绍,包括流行率、临床特点、诊断及治疗方法.【期刊名称】《中国妇幼健康研究》【年(卷),期】2015(026)006【总页数】3页(P1323-1325)【关键词】儿童;人巨细胞病毒感染;流行率;诊断;临床治疗【作者】郑琦;王大利;李悦【作者单位】大连市儿童医院中心实验室,辽宁大连116000;大连市儿童医院中心实验室,辽宁大连116000;大连市儿童医院中心实验室,辽宁大连116000【正文语种】中文【中图分类】R373.9人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)由英国科学家Thomas首次成功分离并命名，属β疱疹病毒亚科，是疱疹病毒中最大的一种双链DNA病毒，长度约为230kb，病毒整体呈球形，直径约为180nm[1]。
该病毒在人群中感染非常普遍，主要表现为不显性感染或潜伏感染，即大部分免疫正常的健康个体，常呈无症状感染，但当免疫力下降或者受到抑制时，便会引起严重疾病。
小儿由于机体阻碍病毒入侵能力差，极易受到感染，尤其是胎儿及免疫力低下的婴幼儿。
目前随着HCMV感染率的不断上升，小儿健康受到了极大的威胁。
本文综合国内外临床调查数据，总结感染该病毒所带来的危害，意在引起临床治疗的重视。
根据其感染次序分为：原发感染(宿主初次感染HCMV，在感染前HCMV血清学阴性)；再发感染(潜伏在宿主体内的病毒被重新激活，进而复制增殖即内源性潜伏病毒活化或再次感染外源性不同病毒株)。
人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒临床应用及初步评价
人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒临床应用及初步评价王述莲;邓中平;呼建民;戴立忠;黄基容;王军;艾颖娟【摘要】目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测试剂（PCR‐荧光探针法）的临床使用及初步评价。
方法：用浓缩一步法试剂与煮沸法试剂对192例临床收集的样本进行HCMVDNA检测并对比其结果，同时，将两种试剂的检测结果分别与HCMV‐pp65抗原检测结果进行对比。
结果：新型人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比98．06％，阴性一致性百分比95．51％，总一致性百分比96．88％；对6例不符样本进行测序复核，并对复核后的结果进行Kap‐pa检验一致性分析，结果Kappa值＝1．000，表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。
在与HCMV‐pp5抗原检测结果的对比中，两种试剂均表现出较好的准确性。
结论：人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂检测结果具有很好一致性，操作简单快速，减少污染环节，并具有内标控制假阴性，结果准确，符合临床检测要求，具有较高的应用价值。
%Objective:The goal of this study is to evaluate the clinical application of a new Human Cyto‐megalovirus DNA Diagnostic Kit (refer to as concentrated one‐step method hereafter) .Methods:A total of 192 clinical specimens were detected by concentrated one‐step method and another kind of fluorescence diagnostic kit u‐sing boiling method ,The results were analyzed a nd compared .Simultaneously ,HCMV‐pp65 antigenemia test re‐sults of these 192 specimens were gathered and compared with the results from the one step and Boiling method kits . Results :The two kits showed excellent agreement The Positive consistency was 98 .06% ,the negative consistency was 95 .51% and the total consistency was 96 .88% ;6 cases ofdiscrepant samples were sequenced review ,then the results were performed with the Kappa consistency analysis ,The value ofKappa=1 .000 ,showed good consistency between the two methods .In addition ,compared with HCMV‐pp65 antigenemia test results ,the two reagents both showed good accuracy .Conclusion :The one step method showed good consistency compared with the conventional boiling method ,In this method ,the nucleic acid targets extracted by lysis buffer all went into the PCR reaction .This avoids laboratory contaminations which occur often during routine DNA extraction process .And the PCR detection system uses an internal positive control (internal control) to avoid a false negative result .With a simple procedure , precise results ,this new diagnostic kit is suitable for routine clinical lab usage .【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】3页(P1542-1544)【关键词】巨细胞病毒感染;脱氧核糖酸酶类/分析;荧光免疫测定;聚合酶链式反应;试剂盒,诊断;煮沸法【作者】王述莲;邓中平;呼建民;戴立忠;黄基容;王军;艾颖娟【作者单位】武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;湖南圣湘生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】R446人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）亦称细胞包涵体病毒，为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，所以称为巨细胞病毒。
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人巨细胞病毒核酸定量核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。
2.应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）和PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、ABI Prism 7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA 检测。
3.职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容4.1 实验原理和临床应用本品选取人巨细胞病毒珠（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp,利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。
本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测，用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控，不用于血源筛查。
本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。
4.2标本采集4.2.1 使用标本类型：尿液、乳汁、血清和淋巴细胞4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1 尿或乳汁：取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。
标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。
4.2.2.2 血清：用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管，4℃静置过夜。
吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5mlEppendoff管中，即为血清标本。
标本可立即用于测试（48小时以内），也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
4.2.2.3 淋巴细胞：取静脉血（EDTA抗凝）1ml,利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。
标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。
4.3 试剂准备4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品处理：分别取出阴性、阳性质控品，8000rpm离心数秒，各吸50ul至1.5ml 灭菌离心管中，瞬时离心后95℃干浴2min，立即冰浴2-5min后13000 r/min离心1min，上清液用于PCR扩增。
4.5.1.2 样本处理4.5.1.2 样本处理4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000rpm离心5分钟，上清备用。
4.5.2 加样: 从4℃冰箱取出处理好的样本以及质控品转移至加样区，取上清液5ul加至PCR 反应管进行PCR扩增。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。
打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。
如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。
(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。
在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）。
4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。
4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard （标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。
对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。
方法为：点击，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。
也可以直接点击标准品的各个孔位，在一栏，手工输入浓度。
若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。
或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。
4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。
在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。
要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。
如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。
点击，导入以前设定的PCR程序。
（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。
可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。
若要去除，可将其拖出循环设定区域。
4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。
会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。
在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。
还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。
4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。
可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。
点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。
左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。
右边的可根据自己的需要选择显示的界面。
是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。
4.5.3.11分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing 对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。
点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。
在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。
4.5.3.15 分析质控结果：阴性质控品：GBS(FAM)Ct值= 40或“No Ct”，内参照（HEX）Ct值<40，且有较好的对数增长曲线。
阳性质控品：GBS（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增长曲线；内参照（Texas Red）Ct值≤40。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。
4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。
4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。
4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。
4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：。
4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。
4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。
4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。
4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。
4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。