传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定

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传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定

传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤）摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。

结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。

鉴定出包括短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。

结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。

通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。

关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from ChineseT raditional SourdoughLIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1(1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory ofFood Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)(2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK)Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and evenpathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples.Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826）作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。

食品中常见发酵菌的检测与分离

食品中常见发酵菌的检测与分离食品是人类生活中不可或缺的重要组成部分，而食品卫生安全则是人们关注的重要问题。

随着科技的不断进步，对食品中微生物的检测与分离技术也日益完善。

在食品中，常常会存在一些发酵菌，它们具有一定的功效和特性，但也可能对人体产生不利影响。

因此，对食品中常见的发酵菌进行检测与分离显得尤为重要。

一、发酵菌的定义与分类发酵菌是指能够在特定条件下，利用食品中的营养物质进行代谢活动，从而产生有益产物的微生物。

在食品中，常见的发酵菌有乳酸菌、酵母菌和霉菌等。

乳酸菌能够将碳水化合物转化为乳酸，从而产生酸味和香味，例如常见的酸奶。

酵母菌则可以利用糖类转化为酒精和二氧化碳，用于发酵面包、啤酒等食品。

而霉菌则以其特有的味道和风味，为食品提供独特的风味。

二、发酵菌的检测技术为了保证食品的卫生安全和品质稳定，对食品中的发酵菌进行检测是必不可少的。

目前，常用的发酵菌检测技术主要有传统培养法、分子生物学方法和生物传感器技术。

1. 传统培养法传统培养法是最常用的发酵菌检测方法之一。

通过提取食品中的微生物样品，然后进行培养、分离和鉴定，用于研究不同发酵菌的特性。

这种方法具有操作简单、可靠性高等优点，但也存在培养时间长、需要专业设备等限制。

2. 分子生物学方法分子生物学方法是近年来发展起来的一种检测技术，它利用DNA或RNA进行特异性检测。

例如，PCR（聚合酶链反应）可以从食品样品中放大微生物的DNA片段，从而快速、准确地检测发酵菌的存在。

这种方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但需要一定的实验条件和专业知识。

3. 生物传感器技术生物传感器技术是一种新兴的检测方法，它利用生物感知元件与传感器技术相结合，能够实现快速、灵敏和便携的检测。

例如，生物传感器可以通过特定的信号转导途径，检测到食品中发酵菌的存在，并输出相应的信号。

这种方法具有实时性强、便携性好等优点，但需要进一步的研究和应用。

三、发酵菌的分离技术在食品中，为了了解不同菌种的特性和功能，需要对发酵菌进行分离。

新疆传统发酵酸奶中酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

摘要：从新疆塔城地区哈萨克族不同牧场家庭中自然发酵牛乳采集１８份样品，从中分离筛选得到４７株酵母菌，并进行形态鉴定、生
理生化鉴定、聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ＿ＤＧＧＥ），２６ＳｒＤＮＡ分子生物学鉴定，构建系统发育树。结果表明，４７株菌中包括库德毕赤酵母（ＰｉｃｈｉａｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉＤ１８株，阿萨希丝孢酵母菌（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉ￣３１０株，酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）７株，丝孢酵母（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｃｏｒｅｍｉｉｆｏｒｍｅ）４株，马克斯克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）４株，东方伊萨酵母（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）２株，发酵毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）１株，近平滑假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ｌ株。鉴定结果对进一步认识并利用哈萨克族传统发酵
ｈｅ口ｔｈｖｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈｅｔｓｒａｔｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｉｅｆｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１８ｓｒａｔｍｓｏｆｃｈｉａｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ，１０ｓｒａｔｍｓｏｆＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉｉ，７ｓｔｒａｉｎｓｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，４ｓｒａｔｉｎｓｏｆＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｃｏｒｅｍｉｉｆｏｒｍｅ，４ｓｔｒａｉｎｓｏｆＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ，２ｓｒａｔｍｓｏｆＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，１ｓｔｒａｉｎｏｆＰｉｃｈｉａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，ＩｓｒａｔｉｎｏｆＣａｎｄｉｄａｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｉｃｆａｎｔｔｏｒｅｃｏｇｎｉｚｅａｎｄｕｔｉｌｉｚｅｈｅｔｒｅｓｏｕｒｃｅｏｆｙｅａｓｔｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＫａｚａｋｈｆｅｒｍｅｎｔｅｄｙｏｇｕｒｔ．

传统面食发酵剂中酵母菌的分离鉴定

传统面食发酵剂中酵母菌的分离鉴定
王乃鑫;韩烨
【期刊名称】《食品与机械》
【年(卷),期】2007(023)005
【摘要】从民间发酵传统面食用的发酵剂中,分离纯化出4株酵母,通过菌落形态观察、细胞形态观察、子囊孢子形态观察、菌丝观察、掷孢子的形成试验、糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验、耐高糖试验、分解尿素试验、产生类淀粉试验、产酯试验、石蕊牛乳试验、无维生素培养基培养试验、热致死试验、耐酒精试验等,将其确定到属,初步鉴定为:丝孢毕赤氏酵母属(Hyhpopichia),酵母属(Saccharomyces),球拟酵母属(Torulopsis).
【总页数】3页(P20-22)
【作者】王乃鑫;韩烨
【作者单位】天津大学农业与生物工程学院,天津,300072;天津大学农业与生物工
程学院,天津,300072
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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酸面团中酵母菌筛选及发酵特性的研究

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作者:潘向辉
学位授予单位:河北农业大学
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传统酸面团菌群结构及其酵制馒头风味物质分析

传统酸面团菌群结构及其酵制馒头风味物质分析李晓敏1，韩伟2，黎琪1，王晴1，檀馨悦1，邹球龙1，张晓琳1,*（1.中粮营养健康研究院有限公司，营养健康与食品安全北京市重点实验室，老年营养食品研究北京市工程实验室，北京102209；2.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京100037）摘要：为探究传统酸面团的菌群结构及其对制成馒头风味物质组分的影响，分别对采自山西（SX）、河北（HB）、青海（QH）、甘肃（GS）和河南（HN）酸面团样品进行pH值、可滴定酸度（titratable acidity，TTA）和菌落总数的测定，运用高通量测序技术对5 个样品进行菌群结构解析，并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对其酵制馒头的风味物质进行检测与分析。

结果表明：酸面团的pH值处于3.69～3.83之间，TTA范围为3.73～4.30 mL（0.1 mol/L NaOH溶液），乳酸菌菌落数范围为4.89～8.31（lg（CFU/g）），酵母菌菌落数范围为4.75～6.08（lg（CFU/g））；酸面团中细菌的优势菌群为乳杆菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属，真菌的优势菌群为酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属，且不同样品的优势菌属和相对丰度有所差异。

酸面团样品酵制馒头风味物质的检测结果显示，共有42 种挥发性成分被检出，包括醇类、醛类、酯类、芳香类、烃类等；其中，HB样品检出成分最多，为30 种，SX、QH和GS样品为26 种，HN样品为25 种。

不同馒头样品风味物质总含量排序为SX＞HN＞GS＞QH＞HB。

关键词：酸面团；风味物质；微生物多样性；高通量测序；气相色谱-质谱联用Analysis of Microbial Community Structure in Traditional Sourdough and Flavor Components inSteamed Bread Made with ItLI Xiaomin1, HAN Wei2, LI Qi1, WANG Qing1, TAN Xinyue1, ZOU Qiulong1, ZHANG Xiaolin1,*(1.COFCO Nutrition and Health Research Institute, Beijing Key Laboratory of Nutrition & Health and Food Safety, Beijing Engineering Laboratory of Geriatric Nutrition & Food, Beijing102209, China; 2. Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing100037, China)Abstract: This study is aimed to figure out the structure of the microbial community in the traditional sourdough and to determine the flavor components of steamed bread made with it. The pH, titratable acidity and total bacterial colony counts of sourdough samples collected from Shanxi (SX), Hebei (HB), Qinghai (QH), Gansu (GS) and Henan (HN) provinces were measured, and the composition of the microbial communities in the five samples were determined by high-throughput sequencing. Besides, solid phase micro-extraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) was used to determine the flavor compounds in steamed bread. The results showed that the pH of these sourdoughs was between 3.69 and 3.83, the total titratable acidity (TTA) ranged from 3.73 to 4.30 mL, as determined by titration with 0.1 mol/LNaOH, and the number of lactic acid bacteria and yeasts ranged from 4.89 to 8.31 (lg(CFU/g)) and 4.75 to 6.08 (lg(CFU/g)), respectively. Lactobacillus, Lactococcus and Weissella were the dominant bacteria in the sourdoughs, and the dominant fungi were Saccharomyces, Pichia and Candida. Besides, the relative abundance of the dominant bacterial and fungal genera was different among the different samples. In total, 42 volatile compounds were identified in all samples, including alcohols, aldehydes, esters, aromatics and hydrocarbons, 30 of which were found in sample HB, 26 in samples SX, QH and GS, respectively, and 25 in sample HN. The total contents of flavor compounds in steamed breads made with the five sourdoughs were ranked in decreasing order as follows: SX > HN > GS > QH > HB. Keywords: sourdough; ﬂavor compounds; microbial community diversity; high-throughput sequencing; gas chromatograph-mass spectrometryDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200109-107中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）10-0162-09收稿日期：2020-01-09基金项目：北京市科技计划项目（D171100008017001）第一作者简介：李晓敏（1987—）（ORCID: 0000-0002-9583-1776），女，助理研究员，硕士，研究方向为食品微生物。

酵母菌的筛选思路和分离筛选流程

酵母菌的筛选思路和分离筛选流程
酵母菌的筛选思路和分离筛选流程通常包括以下几个步骤：
1. 采集样品：从自然环境中或已知的发酵样品中采集可能含有酵母
菌的样品，如水、土壤、植物材料、发酵食品等。

2. 预处理样品：对样品进行预处理，如去除杂质、抑制细菌生长等。

这可以通过过滤、离心、稀释等方法实现。

3. 分离酵母：将预处理后的样品通过不同的分离方法（如稀释涂布法、滴管稀释法、涂布法等）分离到培养基上，使单个酵母菌落生长。

4. 筛选途径：根据所需目标酵母菌的特征，选择特定的筛选途径加
以筛选。

- 抗性筛选：在培养基中添加特定的抗生素或抗菌药物，可以筛选出对此类物质具有抗性或耐受能力的酵母菌。

- 产物筛选：培养基中添加特定的检测试剂或基质，通过对应的反应或变色现象，筛选出产生特定产物的酵母菌。

- 形态特征筛选：通过观察酵母菌的形态特征，如菌落形状、颜色、纹理等，筛选出符合要求的酵母菌。

- 发酵能力筛选：通过检测酵母菌的发酵能力，如对糖类底物的发酵能力，选择具有高发酵活性的酵母菌。

5. 分离纯培养：将筛选出来的单个酵母菌菌落分离到新的培养基上
进行纯培养，以获得纯种的酵母菌。

6. 鉴定酵母菌：通过形态学观察、生理生化特征、分子生物学方法
等对所分离出的酵母菌进行鉴定，确定其菌种。

值得注意的是，以上步骤仅为一般的酵母菌筛选思路，具体的筛选
方法和流程可能会因实验目的和需要而有所差异。

探究馒头用酸面团中自然发酵种的最初来源_张红_胡青平

海市博迅实业有限公司医疗设备厂；101-3BS 电热鼓风干燥箱金坛市荣华仪器制造有限公司。
1.2 方法
1.2.1 初探酸面团中自然发酵微生物的最初来源经 121℃高压蒸汽灭菌锅内 20min 制备无菌面粉和无菌水适量备用。取面粉 20.0g，水 10.0mL 揉捏至表面光滑且内部均匀没有硬块为宜[7],经保鲜膜包裹，放入无菌
中图分类号：TS2 文献标识码：A
馒头是我们北方日常生活中常见的一种主食。传统的制作方法是在面粉中加入一定量的水和酸面团然后和成面团，再经过发酵，揉制，成型，醒发，最后通过汽蒸熟化定形而成的一种面制食品[1]。酸面团是由谷物、水、发酵微生物经过发酵制成的一种面制品，它在发酵面食中起着非常重要的作用。它不仅可以改善面团的质构、风味、口感等，而且可以防止因真菌和细菌引起的腐败[2]。随着社会的进步，人们对馒头的质量也提出了更高的要求，替代品的作用效果远不及传统的酸面团，不能满足人们的需要，因此酸面团再度受到极大的关注[3]。
Table1 The experimental design of the original sources of natural fermentation microorganisms in sour dough
试验设计
面粉（20.0g）
未灭菌
灭菌
水（10.0mL）
自来水
无菌水
保鲜膜
1
+
-
-
+
2
-
杀菌作用，并且空气中没有微生物生长繁殖所必需的营养物、充足的水分以及其他条件。因此，它不适宜
微生物的生存。水中没有供酵母菌和乳酸菌利用的营养物质，因此含量也很少。由图1可知试验2、3、4的
pH下降也很明显，这是因为保鲜膜上附着着一些霉腐微生物，这些微生物会利用面粉中的淀粉产酸。由图

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结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。

结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。

通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。

上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。

究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品114质低，复蒸性能差[2]。

而传统发酵剂中包含以酵母菌和乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）为主[3]的多种微生物，面团发酵时各种微生物同时起作用，协同进行糖化、蛋白分解、酯化、产气等过程，代谢物质丰富，因而发酵的面食感官品质更佳。

酵母菌发酵产生大量气体，使面团体积膨大，面团蓬松；乳酸菌则酸化面团，改善面团质构，产生包括挥发酸在内的各种风味成分。

此外，乳酸菌分泌的胞外多糖可以延缓面制品老化，产生的抑菌物质可以有效抑制有害细菌和真菌的生长，延长馒头、面包等的保藏时间等。

这些都是单一的酵母发酵所欠缺的，因而采用传统面食发酵剂制作的馒头、包子等食品深受人们的喜爱。

但是，由于传统发酵是混菌体系发酵，且易受环境因素、个人经验等因素的影响，造成产品品质的不稳定。

而且，传统发酵剂大多为自然发酵，家庭自用或作坊式生产，卫生条件较差，其中可能含有一些杂菌甚至是有害菌，而以往的菌相研究绝大多数集中于酵母和乳酸菌，忽略了其他的菌群，致使无法全面地解析传统发酵剂的菌相。

西方国家对酸面团已经开展了几十年的研究，有力地促进了其传统主食面包的工业化。

相比之下，我国对传统面食发酵剂的研究起步较晚，目前，主要集中于对传统发酵剂菌相的研究，发酵剂制备工艺的改良，优良菌种的筛选与复配等，尚缺乏对酸面团发酵机理的研究。

而对其开展深入研究是提升传统主食的品质，促进其工业化生产，保证食品安全的基础。

本文在实验室已有工作的基础上[4]，对采自六个省份的传统发酵剂中的优势酵母、乳酸菌以及其他细菌进行了分离、纯化与鉴定，进一步了解我国传统发酵剂中的优势菌群和存在的微生物种类，为后续研究各微生物相互作用及其影响酸面团发酵的机理奠定基础。

1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样品来源从以馒头为主食的地区收集了六份传统面食发酵剂，分别收集自山西吕梁、陕西西安、河南安阳、河北石家庄、山东泰安和安徽亳州。

酸面团收集后于冰箱中4 ℃保存备用。

1.1.2 培养基及主要试剂YPD培养基（2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母膏，固体加入2%琼脂粉）、WL培养基[5]、SDB培养基[6]、牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂粉2%，pH 7.2~7.4）、MRS培养基，杭州微生物试剂有限公司；M17培养基，青岛海博生物技术有限公司；Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒，杭州爱思进生物技术有限公司；基因组DNA快速抽提试剂盒（酵母），上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 主要仪器YQX-Ⅱ型厌氧培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；Powerpac Basic电泳仪，ALS-1296 PCR仪，BioRad生命医学产品有限公司；5417R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；PB-10型pH计，德国Sartorius 公司；ChamGel 5000凝胶成像仪，北京赛智创业科技有限公司。