医蓓舒高危HPV多克隆抗体的制备与应用
多克隆抗体制备课件
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般 采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部 两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内 易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有 利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类 应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后 再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
多克隆抗体的制备
免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、 免疫次数、免疫间隔等因素。
免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动 物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜 过大，以免产生免疫麻痹。 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结 等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可 采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二 次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后 间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱， 抗体效价不高。
纯度鉴定： 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 双向扩散试验、免疫电泳等方法。 IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳 带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗 体混有杂蛋白，需进一步纯化。
结合活性鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、 ELISA或RIA竞争结合试验等。
免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增 强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应 答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；
生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日 咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰 二肽和细胞因子等；
增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属 差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或 亲缘关系越近，免疫效果越差。
多克隆抗体制备提高效价流程
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多克隆抗体的制备,纯化及检测
利用蛋白质免疫印迹法或免疫电泳方法检查抗体产生情况。
二、亲和层析法纯化抗体
【实验原理】
如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材料中纯化，富集某一含量较低的 目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。另外，如 果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。
适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞
分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在 SDS/PAGE 中为可见的单一带，抗原从凝
胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
⒉ 预放血
轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部
直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液
前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患
处，轻按患处 10 秒-20 秒确定血流停止后方可结束。 ⑵ 将血液在 37°C 恒温箱中放置 30 分钟，再在 4°C 放置过夜。用药铲将血凝块从管
壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g 离心 10 分钟，收集上清液即为抗 血清，可在-20°C 保存数年。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳
【实验目的】
⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备 【实验原理】
当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受 抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗 体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗 原决定簇相结合。
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理可以参考以下步骤：
1. 抗原免疫：使用目标抗原免疫动物，例如小鼠，在一定时间间隔内多次免疫。
抗原可以是纯化的蛋白质、多肽片段或者细胞/组织提取物。
2. 细胞融合：将免疫小鼠脾脏与骨髓中的浆细胞混合，然后使用聚乙二醇等方法促使细胞融合，获得杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮液分别分装于多个培养皿中，含有杀死未融合细胞的培养基中，通过限制性稀释法或离子交换法，筛选出高产、单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养与提取：将筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行扩增培养，获取大量的细胞。
然后通过细胞培养上清液、腹水或腹水灌洗法获得单克隆抗体。
多克隆抗体制备的原理如下：
多克隆抗体是指由多个不同的抗体产生细胞(即多克隆细胞)产生的一类抗体。
其制备的原理是通过免疫动物多次免疫，激发机体产生大量的抗原特异性抗体。
不同的抗原特异性抗体由不同的抗体产生细胞产生，并经过体内的嫁接与筛选，获
得了多个具有抗原特异性的抗体。
多克隆抗体具有较广泛的抗原特异性，可以识别目标抗原的不同位点，因此可以广泛应用于免疫学、分子生物学、生物医学等领域。
多克隆抗体制备
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
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再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
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免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
•
剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
精品课件
鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
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多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体制备流程_概述及解释说明
多克隆抗体制备流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述多克隆抗体制备是一种重要的生物学技术，用于生成大量具有特异性的抗体来识别和结合特定的抗原分子。
这项技术已经广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域，对于疾病的诊断、治疗以及基因工程药物研发都起着关键性作用。
1.2 文章结构本文将对多克隆抗体制备流程进行全面概述和解释说明。
首先在引言部分，我们将对文章的整体内容进行简单介绍，并阐明本篇文章的结构。
1.3 目的本文旨在提供一个清晰而详细地描述多克隆抗体制备流程的指南，使读者能够了解到该过程中各个步骤的目标与实施方法。
同时，我们还将涵盖实验操作中需要注意的事项以及可能出现的常见问题及其解决方案，帮助读者更好地开展多克隆抗体制备相关实验工作。
以上是“1. 引言”部分内容，下面将进入“2. 多克隆抗体制备流程概述”的撰写。
2. 多克隆抗体制备流程概述:2.1 抗原选择:在多克隆抗体制备过程中，首先需要选择合适的抗原。
抗原应具备以下特点：足够纯净、增强免疫原性、易于制备和保存，以及与目标分子高度特异性结合。
2.2 免疫动物选择与免疫原制备:在多克隆抗体的制备中，通常以小鼠作为主要的免疫动物。
小鼠免疫系统响应强且易于操作。
然而，在某些情况下，也可选用其他动物如大鼠、兔子等进行免疫。
针对所选抗原，需要将其与适当的佐剂混合以增强其免疫原性，比如与完全佐剂(Freund's adjuvant)或不完全佐剂(完全佐剂的无菌油乳化液形式)混合。
这有助于激发有效的抗体产生。
2.3 免疫程序与方案设计:在完成对抗原和佐剂的混合后，接下来是根据制备目标和实验需求设计合理的免疫程序和方案。
通常包括首次免疫、增强免疫和最后的终次免疫。
在首次免疫后，需要根据抗体滴度等因素评估免疫反应情况，并判断是否需要进行增强免疫。
增强免疫有助于提高抗体产量和质量。
为了更好地激发和筛选出理想的抗体阳性杂交瘤细胞株，还需要在合适的时间点采集血液样本进行检测，评估抗原特异性IgG水平。
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医蓓舒多克隆卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）
一、IgY的发现； 二、IgY的结构； 三、IgY的特征； 四、IgY的制备； 五、IgY的应用； 六、参考文献。
IgY的发现
1893年Klemperer 用试验首次证明特异 性抗原免疫鸡后，产 生的其中一种抗体会 转移到卵黄中。 鸟类的血液循环 里有三种免疫球蛋白 (IgY、IgA与IgM)，其 中IgA与IgM会在输卵 管中与其他的蛋白质 结合而构成鸡蛋蛋白 的部分，而IgY会经由 蛋黄薄膜转移到蛋黄 中。
医蓓舒HPV多克隆抗体的制备
IgY的其它应用
抗胃肠道感染
轮状病毒(Rotavirus)是最主要造成婴孩传染性肠胃炎的病原 菌，且是目前导致婴幼孩童严重腹泻的主因，在开发中国家，每 天造成2000名左右的新生儿死亡，目前尚无有效的疫苗被发展出 来。许多研究者证明给予口服抗-rotavirus的IgG或IgY，即能有效 控制因轮状病毒感染而引起的腹泻。
IgY的特征
无需采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得抗体; 使用少量抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY; 由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白 之间不会发生交叉血清学反应; 4. 不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合， 避免在免疫检测过程中产生假阴性或价阳性结果; 5. 耐酸，耐碱，巴氏灭菌温度下也不会失活并且在pH值小于3时 仍能保持稳定活性 ； 6. 比起从哺乳类动物提取的抗体更加安全卫生； 7. 对哺乳动物抗原的反应度(sensitivity)高，即输入同等抗原情况 下，免疫反应产生抗体的速度、数量、效价高于哺乳动物； 8. 特殊抗体形成率高； 9. 注射方法比接种疫苗量更多也更安全； 10. 起到预防及补助治疗的作用； 11. 能够迅速应对爆发性疾病。 1. 2. 3.
IgY的发现
IgY普遍存在于鸟类、 爬行动物和两栖类，在 功能上等价于哺乳动物 IgG，但其许多生物学 性质仍未被发现。近来 许多研究者分析了IgY的 基因组成和生物学功能， 而且证实其为哺乳动物 IgG和IgE的直接起源。
IgY的结构
IgY，由两条重链（H） 和轻链（L）组成，重 链（H）由一个可变区 （V）和4个恒定区（C） 组成，没有铰链结构。 完整分子量为180KDa （7.8S），重链为 67－ 70KDa，轻链为25KDa
参考文献
• IgY能在HPV病毒阳性细胞中特异性定位E7蛋白（Arthritis rheum,2003,49(3):328-334.） • 段琳,赵文峰,丁建坤, 等 . 卵黄抗体开发现状及应用进展 . 中国生化 药物杂志,2010,31(3):212~215 • 张绍兰 .鸡卵黄抗体研究进展 .西南军医,2008,(10)3:120~121 • 那红,杨暇中,欧伶.鸡卵黄免疫球蛋白Y的性质.华东理工人学 报,1998,24(2):172~180 • 张明娟,杨军,葛祷,等.抗哇巴因鸡蛋黄I gY与兔抗体I gG在酶联免疫检 测中的比较.中国应用生理学杂志,2007,23(4):505~508 • 史继静,韩莉,刘朝奇,等. HIV- 1 NCp15基因的克隆、蛋白表达及鸡卵 黄抗体的制备.食品科技,2009,34(3):28~31 • 林芳,黄建新,陈超,等.鸡卵黄抗体的制备以及金磁微粒为载体去除人 血浆部分高丰度蛋白的研究. ISSN1007- 8738细晌与分子免疫学杂 志,2008,24(7):706~709
参考文献
• 吴玉龙,张炜明,刘文琪,等.抗SEA鸡卵黄抗体用于血吸虫循环抗原检测 的初步研究.现代生物医学进展,2008,8(12):2416~2418 • Rüdiger Schade,Christian Staak,Coenraad Hendriksen,etc.The Production of Avian (Egg Yolk) Antibodies:IgY.ATLA 24: 925-934 • Kazuyuki Hirai, Hideyuki Arimitsu, Koji Umeda,etc. Passive Oral Immunization by Egg Yolk Immunoglobulin (IgY) to Vibrio cholerae Effectively Prevents Cholera. Acta Med Okayama,2010,64(3):163~170 • Linda W. Chui, Robin King, Jeong Sim. Development of an immunocapturepolymerise chain reaction assay using IgY to detect Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis. The Canadian Journal of Veterinary Research, 2010,74:102~107
200mg IgG per bleed (40 ml 50-100mg IgY per egg (5-7 blood) eggs per week) 200 mg ~ 1500 mg 2-10% no no no no
IgY的特征
IgY的制备
IgY的制备
医蓓舒HPV多克隆抗体的制备
多克隆组合抗体制备
Iห้องสมุดไป่ตู้Y的其它应用
中国上海第三医科大学细菌粘附试验
变形链球菌经特异性IgY不同时间处理后培养，细菌的粘附率与普通 牙膏组和细菌组二项对照组相比，有相当明显的下降(由35.2%大幅度 下降至14.8%)，差异十分显着。
IgY的其它应用
预防龋齿
宝宝康IgY儿童安全牙膏
IgY其它应用
免疫检测
• 抗哇巴因鸡蛋黄IgY检测内源性哇巴因(EO) • 抗HIV-1 NCp15蛋白IgY检测血清中HIV • 抗人血浆白蛋白(HSA)和IgG的IgY去除人血浆部 分高丰度蛋白 • 抗可溶性虫卵抗原(SEA)IgY用于血吸虫循环抗 原检测 • 抗霍乱毒素B亚基IgY(anti-CTB IgY)防止霍乱 • immunocapture - polymerise链反应检测方法开 发利用IgY抗体检测结核分枝杆菌亚种
谢谢！
IgY的特征
Mammalian IgG Avian IgY
Antibody sampling
Antibody amount
invasive
non-invasive
Amount of antibody per month Amount of specific antibody ~ 5% Protein-A/G binding Interference with mammalian IgG Interference with rheumatoid factor Activation of mammalian complement yes yes yes yes
工程菌DNA 扩增技术表达组合抗原 抗体蛋白修饰和 洁净工程技术 推入患处喷洒直接 中和与清除HPV病毒
筛选高危HPV病毒及 妇科炎症组合病原体
注入禽类激发产生多克隆卵黄 免疫球蛋白组合抗体
医蓓舒高活性抗 HPV及妇科炎症复合免疫球蛋白
医蓓舒通过抗体特异性识别，清除涵盖HPV16、HPV18型在内的高危病毒；同时，有效清除白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、毛滴虫 、阴道嗜血杆菌、霉菌。维护女性宫颈及阴道健康。