丙肝病毒分子分型方法
2019年「丙型肝炎防治指南」要点解析
2019年「丙型肝炎防治指南」要点解析2019年「丙型肝炎防治指南」要点解析在刚过去的中华医学会感染病学分会年会、中华医学会肝病学分会年会上2019年更新版《丙型肝炎防治指南》发布。
与旧版相比，新版指南增加了国内外的循证医学证据以及新的治疗方案，即直接抗病毒药物（DAAs）治疗，并对丙型肝炎的预防、诊断和抗病毒治疗进行了明确的规范。
本文通过与2019年版的《丙型肝炎防治指南》对比，为您逐一阐述，新版指南的亮点所在。
流行病学更新流行病学数据。
全球HCV的感染率为2.8%，估计约1.85亿人感染HCV，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例。
我国属HCV低流行地区。
2019年调查显示，我国1-59岁人群抗-HCV流行率为0.43%。
加上高危群体，我国HCV感染者约1000万例。
HCV1b和2a基因型在我国较为常见，其次为2型和3型，未发现基因4型和5型，6型相对较少。
预防除旧版预防措施外，新增对高危人群的筛查。
建议根据我国《丙型肝炎筛查及管理》对丙型肝炎高危人群进行筛查及管理。
自然史及发病机制新增促进疾病进展的高危因素。
年龄在40岁以上、男性、嗜酒（女性或男性50g/d以上）、合并感染HIV并导致免疫功能低下；肥胖、胰岛素抵抗、合并HBV感染、非酒精性脂肪肝、肝脏高铁载量、合并血吸虫感染、肝毒性药物和环境污染所致大的有毒物质、遗传因素等。
新版指南还进一步阐明了发病机制。
丙型肝炎肝损害的主要原因是HCV感染后引起的免疫学反应，其中细胞毒性T淋巴细胞起重要作用。
实验室检查新版指南中实验室检查提至临床诊断之前，并删除血清生化学检测和HCVRNA定性检测段落。
补充抗-HCV检测的化学发光免疫分析法CIA。
并指出抗原检测是在缺乏HCVRNA检测条件时才考虑进行的。
统一HCVRNA定量检测单位为IU/ml。
指南对HCV基因分型的方法及意义进行了具体描述，并表示应在抗病毒治疗前进行该检测。
新增了HCV耐药相关基因检测、宿主IL-28B基因分型。
丙肝基因分型ppt课件
丙型肝炎是由于感染丙型肝炎病毒而导 致肝脏发生炎症坏死和纤维化的一种传 染病，部分丙型肝炎患者可以发展为肝 硬化甚至肝癌，故此病对患者健康威胁 极大
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6种基因分型，意义不同
HCV存在着许多基因型，在世界不同地区 主要分为6个基因型，用数字1-6表示； 50个亚型，用英文字母来表示。
我国常见的丙肝基因型为1b和2a，其中 以1b为主；6型主要见于香港和澳门地区。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ肝基因分型临床意义
肝硬化及肝癌患者HCV-1b型明显高于慢性肝炎。 HCV-1b型复发丙型肝炎其肝病较其他基因型为重。
HCV基因型1a、2a合并HBV感染的发生率较高，大部 分（74%）急性肝炎患者为基因型1a；基因型4感染 易引起失代偿性肝脏并发症；基因型3a感染与肝脏 脂肪变的关系较为密切。
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艾迪康检测丙肝基因分型项目（二）
测序法检测丙肝基因分型 方法学：PCR产物直接测序法 检测1-6型HCV 及其亚型
（1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a, 6b,6k共15种） 报告时间：4个工作日（外省要加上物流时间） 样本要求：血浆或血清1ml
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丙肝基因分型临床意义
HCV基因型与其致病性、肝细胞癌（HCC） 发生及干扰素（IFN）疗效有一定关系。 由于每一基因型均可分布在各期肝病中， 因此HCV基因型不能作为评价肝病严重 程度的一个指标。
1型丙肝使用干扰素治疗较难获得应答， 治疗时间要长，治疗剂量要大，合并用 药剂量也要加大。
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丙型肝炎病毒
丙肝病原学基础与检测技术规范
2 第三章丙型肝炎病毒抗原检测
2.1 丙型肝炎病毒抗原检测结果解释
3 第四章丙型肝炎病毒核酸检测
4 第五章丙型肝炎病毒基因型检测
4 HCV基因分型的临床意义
不同基因型对抗病毒治疗的应答不同，采取的治疗方案也 不同，对RNA定量结果也有一定的影响。基因型的测定有助 于决定抗病毒疗程和药物剂量。根据临床研究结果，在1型患 者中，抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的用药剂量不同对持续 病毒学应答（sustained virologic response，SVR）有明显的影 响，建议疗程为1年，利巴韦林的用量要达到1000～1200 mg/d，尽管如此，其持续病毒学应答仅达到40%～45％；而2 和3型患者，疗程半年，利巴韦林的用量只要800mg/d即可达 到70%～80％的持续病毒学应答。延长疗程或增加利巴韦林 的用量都不能进一步提高SVR率。根据不同的基因型和患者肝 脏病理学改变情况调整疗程和利巴韦林的用药剂量，可以减 少不必要的浪费，同时减轻药物不良反应，提高患者对治疗 的依从性。
制及能力验证 第九章：实验室生物安全。
1.1 第二章 丙型肝炎病毒抗体检测
1.1 第二章 丙型肝炎病毒抗体检测
《规范》依不同检测目的制定了不同的检测 策略：
疫情监测相关的检测策略 临床诊断相关的检测策略 血液筛查相关的检测策略
《规范》在临床诊断中规定了HCV抗体筛查阳性反应后必须进行补充实验 （免疫印迹或NAT）。 《规范》在丙肝临床诊断中引入S/CO比值的使用。 《规范》在血液筛查策略中规定了核酸检测（含pooling PCR）。 《规范》明确丙肝检测实验室质量控制。
丙肝病原学基础 与检测技术规范
目录
一、丙肝病原学基础 二、丙肝实验室检测技术 三、丙肝检测技术规范
丙型肝炎病毒实验活动风险评估报告
一、生物学特性（一）种类和病毒分型丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus，HCV）引起的丙型肝炎曾被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎（PT-NANB）。
病毒颗粒呈球形，有包膜，直径约55~65nm。
基因组为单正链线状RNA，长度约为。
基因组由5'端非编码区（5'UTR）、编码区和3'端非编码区（3'UTR）组成。
5'端非编码区是HCV基因组中最保守的序列，是设计诊断用PCR引用的首选部位。
编码区仅含一个长的开放阅读框（ORF），编码一个大分子的多聚蛋白前体。
该前体蛋白在病毒蛋白酶和宿主信号肽酶的作用下切割产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白。
病毒的结构蛋白包括核心蛋白C和包膜蛋白E1、E2。
非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b。
对于3'端非编码区的功能尚不清楚，可能与病毒复制有一定关系。
根据HCV NS5区基因序列的同源性，可将HCV分为6个基因型，11个亚型，即1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a、6a。
其中，欧美流行株多为1a、1b、2a、2b和3a；中东地区以4a为主；亚洲包括我国以1b、2a和2b亚型较为多见。
（二）来源1989年，美国学者Choo等应用了分子克隆技术在实验室感染PT-NANB的黑猩猩血浆中首次获得了病毒的cDNA克隆，测定了约70%的HCV基因序列，并利用这些基因表达的蛋白质为抗原，检测到PT-NANB病人血清中的特异性抗体。
此后，又获得了来自PT-NANB患者血清的病毒全基因组序列，从而确定了PT-NANB的病原体，并将命名为丙型肝炎病毒。
1991年，国际命名委员会将其归类为黄病毒科丙型肝炎病毒属。
（三）传染源主要传染源为急、慢性患者和无症状HCV携带者。
慢性患者和病毒携带者有更重要的传染源意义。
（四）传播途径传播途径主要为输血及血制品传播。
此外，亦可通过非输血隐性途径的微小创伤、性接触、家庭密切接触及母婴接触进行传播。
丙型肝炎病毒基因分型的研究进展
丙型肝炎病毒基因分型的研究进展丙型肝炎病毒是输血后感染肝炎常见的一种病毒，目前其分为6型，其亚型已经超过100个，由于其复制依赖的酶缺乏校对功能，所以易发生突变，这也是丙型肝炎病毒基因组分型的基础。
其分型的命名因为采取的标准及使用的分析方法不一样也有不同的命名系统。
丙型肝炎病毒基因的检测方法很多，但是不简便经济，而且其与丙型肝炎有很大的关系。
标签：丙型肝炎病毒；基因分型；进展研究在如今生活中，除了乙肝是常见肝病外，丙肝患者的比例越来愈高，究其原因主要是人们对于丙肝的感染途径不了解，未对丙肝给予足够的重视。
其传播途径主要有：①输血及血制品，尤其是反复输血及使用血制品者，据统计，输血后肝炎70%以上是丙型肝炎。
②不正规注射。
③伤口未护理。
④性接触。
⑤母婴传播。
在这几种传播途径中，①④⑤最易感染丙肝。
在日常生活中，人们需要采取相关防范措施，以免感染丙肝。
1 HCV的结构HCV的RNA大约有9500－10000bp组成，其5′非编码区有319-341bp，3′非编码区有27- 55bp。
在5′非编码区下有一开放阅读框（ORF），其基因排列顺序为5’C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能编码多聚蛋白前体（一长3014个的氨基酸）。
经宿主细胞及自身蛋白酶作用可裂解成三种结构蛋白，其分别为核心蛋白、糖蛋白、非结构蛋白三种。
HCV基因标记有很多种，如GP72，其基因标记为E2/NS1。
其糖蛋白能产生抗HCV的中和作用。
还有NS2、NS3、NS4等基因标记。
NS2和NS4的功能可能与细胞膜紧密结合在一起。
NS3参与解旋HCV-RNA 分子，具有螺旋酶活性，以辅助RNA复制，NS5参与HCV基因组复制，依赖于RNA的聚合酶活性。
2 HCV的分型及地理差异目前HCV分型尚无统一的定论，这是因为在研究的过程中采取的技术及研究的位置不一致，因而出现了很多基因分型，这些基因分型没有同一的标准。
综合各个国家的研究结果，大致上可分为6型，其亚型很多。
丙肝不可怕丙肝的抗病毒治疗
Hadziyannis SJ. EASL Annual Meeting. 2002.
942研究：疗效小结
派罗欣® 联合 利巴韦林 1000/1200 mg/日治疗 48 周，持续性病毒学应答率 61% 派罗欣® 联合 利巴韦林 1000/1200 mg/日治疗 48 周，HCV 基因型 1 型持续性病毒学应答率 51% 派罗欣® 联合 利巴韦林 800 mg/日治疗 24 周，HCV 基因型非 1 型持续性病毒学应答率 78%
65% (n = 253)
Hadziyannis SJ. EASL Annual Meeting. 2002.
所有患者治疗结束后随访24周
派罗欣® 180 mg sc qw + 利巴韦林 800 mg qd, 24 周
派罗欣® 180 mg sc qw + 利巴韦林 1000/1200 mg qd, 24 周
派罗欣® 180 mg sc qw + 利巴韦林 1000/1200 mg qd, 48 周
开发聚乙二醇干扰素经历了2代技术
IFN
第一代聚乙二醇干扰素α-2b(12KD）
吸收过快，峰浓度高
PEG位点多样，产品均一性差
分布过广，剂量要大
PEG与干扰素结合不稳定需要制成干粉剂
消除过速，给药要频
在体内分布仍很广泛
波动过大，耐受性差
不能保证稳定1周的血药浓度
第二代大分子支链 PEG干扰素纯度更高
目前治疗丙肝的临床药物
干扰素类 普通干扰素（IFN） 聚乙二醇干扰素 利巴韦林
IFN
第一代聚乙二醇干扰素α-2b(12KD)
第二代聚乙二醇干扰素α-2a派罗欣®(40KD)
丙型肝炎防治指南
・专家论坛・解读《丙型肝炎防治指南》李梦东作者单位:410038 重庆市第三军医大学西南医院作者简介:李梦东 教授,博士生导师 丙型肝炎病毒(HC V )慢性感染可导致肝脏慢性炎症和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC )。
中华医学会肝病学分会和传染病与寄生虫病学分会组织国内有关专家,制定了我国丙型肝炎防治指南(下称指南)[1],对我国丙肝的防治起到了推动和指导作用。
但是,在指南中仍有几个问题存在争议,值得提出来加以讨论。
一、HC V 基因组的结构特点及其亚型 HC V 属于黄病毒科,其基因组为单股正链RNA ,易变异。
S imm onds 把HC V 分为6个基因型(同源性在56%～72%),11个主要亚型(同源性74%～86%),可能还会发现新的亚型。
分型方法有型特异性引物PCR 法、限制性片段长度多态性分析法、经型探针杂交法、直接测序法及基因芯片法等[2]。
当前在较保守的5’非编码区(5’NC 区)已证明至少有12a 、b 、c ,22a 、b 、c ,32a 、b ,4、5及6等6个大的基因型。
美国大多数分离株为基因1a 型(60%)及1b 型(20%)[3]。
王宇等调查证明,我国北方地区(沈阳、哈密及兰州)3型感染率为30%～50%,南方地区(南京、南宁、成都)则以2型感染为主(90%～100%),而杜绍财等的报告则认为北方(北京、西安)2型感染者为80%～85%,3型感染者为15%～19%;南方(重庆、武汉、广州、广西)2型感染者为80%～100%,3型感染者为0～13%[4]。
[指南]中认为我国1b 型(约占60%～80%)和2a 型较常见,其中以1b 型为主,某些地区有1a 、2b 和3b 报道,6型主要见于香港、澳门地区及南方边境省份,在[指南]中提到有3c 型,是很特殊的,但均未说明其地区分布及频率,显然与以往的结果出入较大,而无法参与对比。
也可能因研究方法的不同,所得结果混乱,很难进行正确评估。
丙肝病毒实验室检查方法及结果解释
丙肝病毒实验室检查方法及结果解释1实验室检查方法1.1化学发光实验化学发光免疫分析是将有高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性免疫反应相结合利用各种抗原，半抗原、抗体、激素，酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
化学免疫发光又以标记方法不同分为两种，化学发光标记免疫分析和化学发光酶免疫分析。
化学发光标记免疫分析是利用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法，常用的标记化学物质有吖啶酯类化合物，通过起动发光试而发光，强烈直接发光在1 s内完成。
化学发光酶免疫分析，其操作步骤与ELISA完全相同。
以酶标记活性物质进行免疫反应，只是反应底物为发光剂。
1.2胶体金快速实验免疫渗透实验：斑点免疫胶体金快速实验以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原点状固定在膜上，加待检样品，阳性结果在膜上抗原部位显色斑点。
反应时间在10 min以内有效试验质控点必需显色。
免疫层析试验，以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着载体迁移，阳性结果在膜抗原部位显示出有色条带，有效试验质控线必须显色。
1.3抗体补充试验目前常用抗体补充试验为免疫印迹试验，免疫印迹法试剂一般将HCV不同编码区抗原多种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的IgG对照带的二条hsoD对照带，用于内部对照结果判断。
其诊断HCV感染敏感性高，特异性强，可检测出针对HCV不同编码区抗原的抗体，其不需要特殊仪器设备。
抗HCV检测策略及结果报告，先用筛查试剂进行初策实验，结果呈阴性报告阴性，不在进行复检实验，结果呈阳性反应进入复检试验，复检用筛查试剂2进行，结果呈阴性反应报告阴性，呈阳性反应报告抗HCV阳性。
HCV抗原的检测目的及意义：急性丙型肝炎的辅助诊断，尤其有助于HCV 感染窗口期患者，抗HCV检测结果确定患者或HCV阳性母亲所生婴儿丙型肝炎辅助诊断。
免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HCV感染者的筛查，或是抗HCV 阳性感染者的病毒血液分析，HCV感染者治疗前后，病毒血液分析。
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( 3)型特异性探针杂交( LIPA )
将生物素或荧光素标记型特异性探针固化 相化在膜或芯片
与RT- PCR扩增的病毒产物进行杂交 是建立在5’非编码区基础上 有5% ~ 10%的1 a、1 b 型不能鉴别, 也不能区别2 a 和2 c 型。
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Stuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al. Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping [J]jourhal of Clinical Microbiology，1996；34：2259．
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Antonishyn NA, Ast VM, McDonald RR. et al.Rap id genotyping of
hepatitis C virus by primer- specific extension analysis [J]. Clin
Microbio,l 2005, 43: 5158- 5563.
. 12: 416- 417
20
（8）COMA基因分型法：
原理是基于长异源双链的解链特性不 同．用已知的序列顺序的参考DNA捕获液 相中未知的DNA．
两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体 的两条单链间解链曲线的差异可以推断出 其序列差异
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Genotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay
subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the
5′non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204.
16
( 5)遗传发育关系进化树
对一定区域的样本测序结束后可将序列互 相比较
该方法常用的酶为HaeIII、RsaI 、Mva I 、 Hinf I、Scrf I
该方法检测基因型的精确度为97％ 不能区分所有的HCV基因亚型 也不能识别在泰国和越南发现的变异基因
型，
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Davidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and
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（7）异源分子迁移率法（HMA）：
用已知不同型的HCV 参比DNA 与未知基 因型的HCV 的DNA 分子混合、变性、退 火, 形成同源、异源分子,
这些分子在PA GE 中迁移率不同, 并同异 源DNA 中不同碱基的数目成比例, 来鉴定 基因型
王林, 徐东平, 张灵霞. 丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义[ J]. 肝脏2006,
以阿拉伯 数字表示 HCV 基因 型, 以小 写的英文 字母表示 基因的亚 型(如1 a、 2 b、3 c 等)。
6
HCV 基因型分布
北美: 1, 3, 2 南美: 1, 2, 3 欧洲: 1, 3, 2 非洲: 2, 1, 3, 4, 5, 6 亚洲: 2, 1, 3, 4, 6 中东: 4 中国：1b，2，6
分析样本间序列的进化距离, 画出该区域内 HCV 流行的关系进化树,
观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点
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（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：
利用taq酶在引物3‘末端发生错配时无法继 续延伸
借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达 到分型目的
该方法成为检测混合HCV基因型感染的方 法．比直接测序灵敏度高20倍
4
HCV 基因分型分类系统
不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系 统
主要的命名系统有: Chan系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名 系统
第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上, 制定 了统一的命名系统--Simmonds系统,
5
目前认为 主要有6 种HCV基 因型及不 同亚型,
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HCV 基因分型区域的选择
最准确的方法就是对基因组的某个区进行 PCR 扩增、测序及进化树分析, 选择的区 有NS5、Core、E1和5‘UTR
通常建立在5’ UTR, 因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域
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基因分型的分子学方法
（1）测序法：测全长或片段 金标准 费时费力 不适于临床
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HCV基因
其基因组为单股正链RNA, 易变异。 全长9. 6 kb 341 b的5‘非编码区( 5’NTR, NCR, UTR ) 27b的3’非编码区( 3‘NRT )。 在病毒复制中, 氨基酸有三个蛋白( C、E1、E2 /NS1) 羧基端有4个蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5)
HCV分子分型方法
陈长荣
ID:21620101152367
1
丙肝病毒HCV
1975年, 英国Lancet杂志首次使用非甲非 乙型肝炎这个名词
1989 年, HCV cDNA 克隆成功, 并正式命 名HCV
1991年国际病毒命名委员会( ICTV ) 将 HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属
异性引物PCR法
Okamoto等首先采用 分型的效果仍比较差 需使用7对引物
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Okamoto H et al. J Gen Virol. (1992) Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sourc1e1s.
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HCV genotypes in Northern Italy: a survey of
1368 histologically proven chronic hepatitis C
patients
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( 4)限制性片段长度多态性分析 ( RFLP)法:
用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将 PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段