天然水体中痕量微囊藻毒素的高效液相色谱测定方法优化

天然水体中痕量微囊藻毒素的高效液相色谱测定方法优化刘碧波1,2　肖邦定1,2　刘剑彤31　方　涛1　刘永定11(中国科学院水生生物研究所,武汉430072) 2(中国科学院研究生院,北京100039)摘　要　以微囊藻毒素LR (MC 2LR )和微囊藻毒素RR (MC 2RR )为材料,主要通过调节杂质淋洗液和毒素洗脱液中甲醇、水和三氟乙酸(TF A )的配比来改变极性和PH 值,对高效液相色谱(HP LC )法分析MC 环境样品的方法进行了优化。

结果表明,含0.1%TF A 的40%～45%的甲醇水溶液可以取得较好的杂质淋洗效果;含0.1%TF A 的70%的甲醇水溶液可以将固相萃取柱(SPE )上的MC 完全洗下。

因此,建议在分析杂质较多的环境样品时,使用含0.1%TF A 的40%～45%的甲醇水溶液对杂质进行淋洗,然后用含0.1%TF A 的70%～100%甲醇水溶液对MC 进行洗脱。

关键词　微囊藻毒素,高效液相色谱,天然水体　2004210228收稿;2005205208接受中国科学院重大项目(No .KZCX12S W 212)、国家973项目(No .2002CB412300)和中国科学院水生物研究所创新课题(No .220316)资助项目1　引 言近年来,由水体富营养化导致的蓝藻水华污染已引起全球关注。

蓝藻水华污染所带来的主要危害是有毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的藻毒素[1]。

约有一半的蓝藻水华可产生藻毒素[2]。

微囊藻毒素(MC )是其中最为普遍的一种[3]。

MC 是一种公认的肝毒素和促癌剂[4],水体中MC 主要是通过藻细胞破裂后释放出来的[5],长期暴露会对人的肝脏造成损伤,极端情况下会危及到人的生命[6]。

HP LC 作为一种常用的MC 检测方法,已经得到了广泛的应用。

但是现有的HP LC 方法一般使用20%的甲醇水溶液进行杂质淋洗,这种淋洗液对杂质较少的样品比较有效,但对杂质较多的环境样品的淋洗效果不好,大部分杂质都未被20%甲醇洗下,最终随MC 一起被含0.1%TF A 的100%甲醇洗下。

在进样分析时,由于杂质峰太高,在毒素浓度很低的环境样品中,MC 完全被杂质峰掩盖或者受到严重干扰,而且整个谱图的基线也难以平稳,影响了MC 检测的准确性。

研究表明,甲醇水溶液和TF A 酸化的甲醇水溶液是理想的杂质和MC 洗脱液[7～9]。

Tsuji 等[7]采用正相反相两次固相萃取对MC 样品进行前处理,然后进行HP LC 分析,取得了较好的效果,但是过程较为繁琐,成本也较高,没有得到推广。

本研究以MC 2LR 和MC 2RR 为对象,通过调节杂质淋洗液和MC 洗脱液中甲醇、水和TF A 的配比来改变其极性和pH 值,优化环境样品的前处理过程,并对HP LC 法分析MC 环境样品的方法进行了优化。

2　材料与方法2.1　仪器、试剂与材料JL 2360型超声波振荡器(上海杰理科技有限公司);SHZ 2Ⅲ型循环水真空泵、RE52A 298型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);HJ 26型多头磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司);W aters600型高效液相色谱仪。

实验用MC 为本实验室粗提MC,藻粉(中国科学院水生物研究所滇池工作站提供),水样采自云南滇池。

实验用SPE 小柱为C 18柱(安捷伦公司,500mg,6mL ),甲醇为色谱纯。

2.2　实验方法2.2.1　M C 的提取及样品的准备　称取一定量的MC 干藻粉,按20mL /g 的比例加入75%甲醇作为提取液,室温下搅拌1h,取出后以3000r/m in 的离心10m in,取出上清液。

按此步骤重复提取两次,合并3次提取的上层清液,旋转蒸发除去其中的甲醇待用。

将MC 粗提液配成已知浓度的MC 水样,取500mL 过预先活化的SPE 小柱(使用前经10mL 甲醇第33卷2005年11月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry 第11期1577～1579活化,10mL 重蒸水调整),小柱吹干密封,4℃保存备用。

2.2.2　杂质淋洗液优化　用10mL 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%及50%甲醇水溶液作为淋洗液,对样品中杂质(每组实验设3个平行样)进行淋洗,再用含0.1%TF A 的100%甲醇洗脱MC,杂质淋洗液和MC 洗脱液分别进样分析,对比不同浓度甲醇水溶液的淋洗效果。

用10mL 含0.1%TF A 的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%及50%甲醇对杂质较多的样品(每组实验设3个平行样)进行淋洗,再用含10mL 0.1%TF A 的100%甲醇洗脱MC 。

杂质淋洗液和MC 洗脱液分别进样分析,对比各种淋洗液的淋洗效果。

2.2.3　M C 洗脱液的优化　用10mL 0.1%TF A 的50%甲醇水溶液对已知浓度的MC 样品进行杂质淋洗,再分别用含0.1%TF A 的70%、80%、90%和100%甲醇水溶液洗脱MC (每组实验设3个平行样),分析MC 洗脱液中的MC 浓度,比较MC 的洗脱效果。

2.2.4　M C 分析及HPLC 系统　所有洗脱液均经旋转蒸发后,用75%甲醇定容至300μL,然后进样分析。

半制备型HP LC 系统:W aters 600型高效液相色谱仪,由控制器、四元梯度泵和2487双波长紫外/可见检测器组成,分析柱:BDS Hypersil C 18(4.6mm ×250mm );柱温为25℃;流动相:甲醇/水(62∶38,V /V ,含0.05%TF A );流动相流速为1mL /m in;进样量为20μL 。

3　结果与讨论3.1　杂质的淋洗杂质淋洗实验表明,浓度高于50%的甲醇也并不能洗下SPE 小柱上的MC 。

不同浓度的甲醇水溶液对杂质的淋洗能力是随着甲醇浓度的升高而增加。

相比之下,含TF A 的甲醇水溶液的淋洗效果更好。

经过对不同浓度的酸化甲醇水溶液的杂质淋洗能力比较发现,含0.1%TF A 的35%甲醇水溶液以及甲醇浓度更低的淋洗液淋洗效果不好,当甲醇浓度增加至40%时淋洗液中的杂质明显增加(图1)。

当甲醇浓度增加至50%时,洗下的杂质量增加,同时也只能洗下少量的毒素(MC 2LR )(表1)。

已有的报道表明,5mL 20%、30%和40%甲醇水溶液淋洗杂质,结果对回收率没有影响[9]。

本实验也发现,用10mL 50%及浓度更低的甲醇水溶液淋洗杂质,结果对回收率没有影响[9]。

实验发现,用10mL 50%及　图1　不同浓度杂质淋洗液杂质峰比较Fig .1　Comparis on of the peaks of i m purity in different rinse s oluti on 流动相(mobile phase ):甲醇(methanol )∶H 2O (contai 2ning 0.05%TF A )=62∶38;流速(fl ow rate )=1.0mL /m in,λ=238nm,T =25℃。

浓度更低的甲醇水溶液林洗杂质,并不能洗下MC 。

但是,张维昊等[10]用5%甲醇淋洗的方法,并指出高浓度(25%以上)的甲醇淋洗会造成MC 的流失。

其原因应该是实验中所使用的SPE 小柱吸附性能上存在差异导致的。

表1　杂质淋洗液中MC 含量Table 1　Concentrati on of m icr ocystins (MCs )in rinse s oluti on甲醇MethanolMC 2RR (μg )MC 2LR (μg )0.1%TF A +30%甲醇(methanol )ND ND 0.1%TF A +35%甲醇(methanol )ND ND 0.1%TF A +40%甲醇(methanol )ND ND 0.1%TF A +45%甲醇(methanol )ND ND 0.1%TF A +50%甲醇(methanol )ND 0.18　ND:not detected;TF A:trifluor oacetic acid3.2　M C 的洗脱经过对含0.1%TF A 的70%、80%、90%和100%甲醇水溶液洗脱能力比较表明(表2),含0.1%TF A 的70%甲醇水溶液已经能将MC 完全洗下。

再用含0.1%TF A 的100%甲醇水溶液洗脱后进样,没有发现MC,但仍有少许杂质峰。

这表明甲醇浓度达到70%后,再增加甲醇浓度洗脱MC 已经没有作用,只能洗下更多的杂质。

各种洗脱液回收率如表2,其中MC 2LR 回收率偏低的原因是由于含0.1%TF A 的50%的甲醇水溶液洗下了少量MC 2LR,如果改用甲醇浓度较低的洗脱液,其回收率应该会更高。

研究表明,90%甲醇作为洗脱液,会将一些杂质同时洗脱,造成色谱峰干扰严重[10]。

同时,30mL8751 分析化学第33卷90%甲醇水溶液[7]或者是3mL TF A 酸化的甲醇溶液[8,9]可以将SPE 柱上的MC 完全洗脱下来。

但是,在MC 洗脱液蒸干浓缩的过程中,甲醇浓度越高,浓缩越快。

甲醇浓度的降低会大大地增加浓缩的时间。

　图2　滇池水样中MC 检测色谱图Fig .2　MCs chr omat ogram of water sa mp le inD ianchi Lake色谱条件同图1(the sa me chr omat ography conditi onas Fig .1)。

因此,在回收率相当且对MC 检测无显著干扰的条件下,可表2　不同洗脱液对MC 洗脱的回收率比较Table 2　The comparis on ofMCs recoveries with different eluted s oluti ons洗脱液Eluent (%)LR 回收率Recovery RR 回收率Recovery 70甲醇(methanol )+0.1TF A90.2±294.3±280甲醇(methanol )+0.1TF A88.2±293.3±290甲醇(methanol )+0.1TF A91.3±293.1±2100甲醇(methanol )+0.1TF A 89.2±295.7±2　使用浓度较高的甲醇水溶液作洗脱液。

在检测滇池水体中MC 样品时,先用含0.1%TF A 的50%的甲醇水溶液淋洗杂质,再用含0.1%TF A 的90%的甲醇水溶液洗脱MC,可以取得较好的效果(图2)。

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