标准革兰氏染色液
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液Standard Gramˊs StainCatalog No：PH1237Size：☐4×100mL|☐4×250mL Store at RT简介革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。
通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。
细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。
经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。
在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。
红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。
在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。
Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。
组份名称4×100ml4×250ml Storage试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光试剂(C):脱色液100ml250ml RT试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光自备材料1、接种环或挑取细菌的其他工具2、酒精灯3、载玻片4、光学显微镜操作步骤(仅供参考)：1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。
革兰氏染色需要的试剂
革兰氏染色需要的试剂革兰氏染色是一种临床上常用的微生物诊断方法，它是利用细菌的特异性自身的酶和体外物质的反应而使细菌表面有不同的色泽，从而对细菌进行特异性的鉴定。
革兰氏染色需要的试剂有：一、染料：1.革兰氏染色所需要的染料有紫罗兰染料（Gram’s violet）、卡拉氏染料（Kala’s dye）、罗丹明B染料（Ludwig’s B dye）、乙醚紫染料（Ethyl violet）等。
2.紫罗兰染料（Gram’s violet）是在革兰氏染色中通常采用的染料，能与细菌外膜中脂肪、糖等成分发生化学反应，使细菌保持紫色，细菌呈深蓝色。
3.卡拉氏染料（Kala’s dye）是一种无机染料，在细菌外膜中可以形成稳定的络合物，使细菌呈深蓝色。
4.罗丹明B染料（Ludwig’s B dye）是一种无机染料，具有强烈的抗氧化作用，使细菌表面呈褐色。
5.乙醚紫染料（Ethyl violet）是一种有机染料，可以与细菌外膜中的脂肪和糖等成分发生反应，使细菌呈紫色。
二、抗原：1.革兰氏染色中用到的抗原有去氧核糖核酸（DNA）、核苷酸（RNA）、多糖（polysaccharide）、蛋白质（protein）等。
2.去氧核糖核酸（DNA）是细菌表面的一种膜质抗原，可以与染料发生化学反应，使细菌表面呈现出紫色。
3.核苷酸（RNA）是细菌表面的一种膜质抗原，可以与染料发生化学反应，使细菌呈深蓝色。
4.多糖（polysaccharide）是细菌表面的一种膜质抗原，可以与染料发生化学反应，使细菌呈褐色。
5.蛋白质（protein）是细菌表面的一种抗原，可以与染料发生化学反应，使细菌呈黑色。
三、抗性：1.抗性是指细菌在染色过程中可以抗染料的作用，会导致形成的颜色异常，从而影响革兰氏染色的效果。
2.抗性可以分为细菌内抗性和细菌外抗性。
细菌内抗性是指细菌内部存在的特殊酶，如脱氧核糖核酸酶（DNAase）、磷酸核酸酶（RNAase）、多糖酶（polysaccharase）等，可以与染料结合，使其不能达到预期的染色效果。
染色液配制方法
常用染色液的配制1．骆氏美蓝染色液甲液：美蓝0.3g 95％酒精溶液 30ml乙液：0.01％氢氧化钠溶液 100ml甲液与乙液相混合即成。
2．1％美蓝酒精溶液美蓝1g 95%酒精溶液 100ml，充分混合溶解即可。
3．革兰氏染色液（1）草酸铵结晶紫染液甲液：结晶紫2.0g 95％酒精20ml乙液：草酸铵0.8g 蒸馏水80ml用时先以蒸馏水将甲液稀释5倍，然后加20ml于80ml乙液中，混合即成。
（2）革兰氏碘溶液碘片 1g 碘化钾 2g蒸馏水 300ml先将碘化钾置于干净的乳钵中，加入蒸馏水少许（约5ml），待碘化钾完全溶解后，再加入碘片，略作研磨，使碘片完全溶解，然后徐徐加水，充分混合，直至足量。
切忌将碘片与碘化钾一起直接加入瓶中，一次加水配制。
否则，碘片往往不能完全溶解而影响碘的浓度。
（3）95％酒精（4）复染色液可用碱性复红或沙黄液及稀释的石炭酸复红液。
碱性复红液：碱性复红0.1g 蒸馏水100ml，混合即成。
沙黄液：3.41％沙黄酒精溶液10ml、蒸馏水90ml。
稀释石炭酸复红液：石炭酸复红液10ml、蒸馏水90ml，混合即成。
4．抗酸染色液（1）石炭酸复红液 3％碱性复红酒精溶液10ml、5％石炭酸水溶液90ml，二液混合即成。
（2）盐酸酒精溶液浓盐酸3ml、95％酒精溶液97ml，二液混合即成。
5．瑞氏染色液瑞氏染料粉0.1g、纯甘油1.0ml、中性甲醇60ml。
置染料粉于乳钵中，加入甘油，充分研磨，再徐徐加入甲醇，边研磨边搅拌，促其溶解，然后盛于棕色瓶中，置暗处过夜，次日以滤纸滤过后，仍盛于棕色瓶中，保存于暗处备用。
磷酸盐缓冲液：溶液一：Na2HPO4.12H2O（磷酸二氢钠）23.864g、蒸馏水1000ml。
溶液二：KH2PO4（磷酸二氢钾）9.078g、蒸馏水1000ml。
用时以溶液一4份与溶液二1份混合即成。
6．姬姆萨氏染色液取姬姆萨氏染料粉0.6g，加入甘油50ml，置于55—60度温度中1.5—2h，再加入甲醇50ml，静置一日以上，滤过后即可作染料原液用。
革兰氏染色标准操作规程
革兰氏染色标准操作规程1、目的
确保染色结果清晰可靠。
2、范围
球菌、杆菌和弧菌染色
3、职责
临床微生物实验室当班工作人员认真按程序文件操作。
5、试剂
5.1结晶紫溶液
A液：结晶紫2g
95%乙醇20ml
Β液：草酸铵0.8g
蒸馏水80ml
使用前24小时将A液Β液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。
5.2碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
5.3脱色液：95%乙醇
5.4复染液
储存液：沙黄2.5g
95%乙醇100ml
应用液：储存液10ml
蒸馏水90ml
6、工作程序
6.1待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥后用火焰固定。
6.2加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。
6.3加碘液染1分钟，清水冲去染液。
6.4加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30秒钟，至紫色已脱落为至，水冲洗。
6.5加复染液（伊红），染30秒钟，水冲洗。
6.6待涂片自然干燥后，油镜镜检。
7、质量控制
金黄色葡萄球菌为革兰氏染色阳性,大肠埃希菌为革兰氏染色阴性。
8.参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.《全国临床检验操作规程》（第三版）.2006, 第六篇P725。
北京普利莱基因技术有限公司 革兰氏染色液 产品说明书
北京普利莱基因技术有限公司 电话：010-******** 62053186 Email:***********************Applygen Technologies Inc. DocRev: 201910 Page 1 of 1 B1083 革兰氏染色液描述： 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。
大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病；而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，内毒素使人致病。
革兰阴性菌和阳性菌的致病特征和对抗生素的敏感性有明显差异，临床上明确感染性疾病的致病菌类型和特征，对于疾病的治疗具有重要的指导意义。
革兰氏阳性菌的细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障。
革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类含量高，用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁通透性增强。
革兰氏染色可以将两种细胞壁结构不同的细菌区别开来。
在革兰氏染色实验中，首先用可将细胞核染成深紫或深蓝色的碱性染料结晶紫（龙胆紫，晶紫）染色，使革兰氏阳性菌和阴性菌着色呈现紫色。
再加入碘液，碘在菌体内可与结晶紫和核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，该结合物不易被酒精脱掉。
当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故结晶紫-碘复合物保留在细胞膜上。
经乙醇处理后革兰氏阴性菌的细胞壁通透性增大，结晶紫极易被乙醇抽出而脱色。
再度用番红或品红复染时，可使革兰阴性菌呈现复染液的颜色红色。
适用范围： 适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的鉴别，指导临床感染性疾病的治疗。
组成(各100mL)： 1. 结晶紫染液 2. 碘液 3. 脱色液 4.复染液储存： 室温避光保存12个月样本处理：1. 用枪头滴一滴菌液于载玻片上，并均匀涂开。
2. 待干后在酒精灯上迅速过火两次。
染色方法：1. 用结晶紫染色液染色约1分钟后，倒去染色液，细水冲洗。
2. 加碘液染色1-2分钟，细水冲洗。
3. 加脱色液脱色约半分钟，细水冲洗。
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液配制文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-革兰氏染色液保质期：2-8度一年.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。
革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
操作步骤：1、标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。
（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。
制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
3、染色方法：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。
（1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。
（3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。
4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。
注意事项：1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
4．碘液变透明，则不能使用。
革兰氏染色操作规程
1 目的
建立微生物实验室细菌形态和主要构造检验方法，以鉴定菌种。
2 范围
本规程适用于我司革兰氏染色测试实验。
3 职责
质量部微生物实验员负责按此规程进行革兰氏染色测试。
4 染液的配制
4.1 0.5%结晶紫染色液
称取1g结晶紫，放入250ml试剂瓶中，加95%乙醇2ml,溶解后加入200ml蒸馏水摇匀即可。
4.2 革兰氏碘液
分别称取碘 1g和碘化钾2g放入蒸馏水300ml中，溶解摇匀即可。
4.3 脱色剂
95%乙醇
4.4 复染液（番红染液）
称取番红0.25g，加入10ml 95%乙醇内，然后用90ml蒸馏水稀释，摇匀即可。
5 革兰氏染色程序
5.1 涂片
用纱布擦净载玻片，以无菌接种环取一小滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取少数菌苔（菌落）或液体培养物（不必加生理盐水），在玻璃片中央涂成一薄膜。
5.2 干燥
涂片后放室温中自然干燥。
5.3 固定
将载玻片迅速通过火焰三次（其目的是杀死细菌），使菌体与载玻片粘附牢固，以及改变对染料的通透性。
5.4 初染
滴加结晶紫染液于已固定的载玻片上，染1min，水洗。
细菌的革兰氏染色及染色液的配制
革兰氏染色的一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1 分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。
染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。
被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。
革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。
致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。
百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。
所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。
又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染 1 分钟。
3）纯化水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染 1 分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加 95% 酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30 秒后水洗，吸去水分。
7）番红染色液（稀）染10 秒钟后，纯化水冲洗。
干燥，镜检。
染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
实验三细菌的革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是 1884 年由丹麦医师Gram 创立的。
革兰氏染色法（ Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+ 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G- 表示。
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标准革兰氏染色液
简介：
革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。
通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。
细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。
经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。
在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。
红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。
在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。
Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。
组成：
自备材料：
1、 接种环或挑取细菌的其他工具
2、 酒精灯
3、 载玻片
4、 光学显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与
的水混合均匀，涂成一薄层。
编号 名称
DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml
100ml
250ml 500ml
RT 避光
使用说明书
1份
2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。
3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动，温度不宜过
高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。
也可以用甲醇或乙醇固定。
4、初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。
5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。
6、脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，
终止反应。
7、复染：滴加沙黄染色液染色，水洗。
8、干燥。
镜检：置油镜观察。
染色结果：
革兰氏阳性菌蓝色至紫色
革兰氏阴性菌红色
注意事项：
1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。
2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将
接种环在火焰上烧灼灭菌。
3、加热固定涂片时，应注意玻片勿太靠近火焰，一般要求玻片温度不超过60℃，以玻片
背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。
4、革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度，脱色时间应根据经验判断。
脱色过度，阳性
菌可被误染为阴性菌；脱色不够，阴性菌可被误染为阳性菌。
5、待检细菌培养时间会影响染色，阳性菌培养时间过长或已死亡或细菌溶解，常呈阴性。
6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号名称
DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液
PS0013 RIPA裂解液(强)
TC1243 甘油三脂(TG)检测试剂盒(单试剂GPO-PAP比色法)。