利用不同的方法筛选和鉴定转化子
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
转化子筛选方法
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
转化子的筛选和重组子的鉴定
双脱氧末端终止测序法旳基本操作：
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Prime Prime Prime Prime rKlenow rKlenow rKlenow rKlenow dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
聚丙烯酰胺凝胶电 泳A C G T
pUC18 2.7 kb
ori
后经过其长度来鉴定其是否为重组子 Apr
区别重组子与非重组子
假如外源DNA片段插pUC18 旳SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这么做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解一样 能够到达目旳，但这两种酶 旳价格只及SphI旳1 / 50
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap旳平板
再将Ap平板上旳转化子影印 至具有Ap和Tc旳平板上
缺刻前移标识法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓旳限制性酶切图谱法就是对载体上插入旳外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目旳基因旳已 知图谱对比，所以利用这种措施不但能区别重组子与非 重组子，而且还能鉴定目旳重组子。但这种措施在用于 数千规模旳转化子筛选时，工作量极大，试验成本也高 。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
细菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。
2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。
3. 学习如何筛选和鉴定转化子。
二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。
转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2. 质粒载体：pUC19质粒。
3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。
4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。
（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。
（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。
（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。
（6）4℃下保存备用。
2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。
（2）将混合液转移到电击杯中。
（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。
（4）进行电击转化，时间约为5秒。
（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。
（6）37℃培养1小时。
3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
（2）37℃培养过夜。
（3）观察并记录菌落生长情况。
4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。
2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。
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生物工程上游技术实验综合实验设计
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
生命科学学院
生工121
指导老师: 田长恩、周玉萍
摘要
本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实
验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词
筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳
引言
在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。
同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。
然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。
最后，摇菌培养观察菌株表达形态。
通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。
因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。
通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。
但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。
从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。
三、使用仪器、材料
1、材料：实验九准备好的菌株。
2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。
3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基：
四、实验步骤
1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌
落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。
2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的
底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。
反应体系如下:
DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹）
10×PCR buffer 6μL
dNTP mixture 4.8μL
前向引物(P1) 2.4μL
反向引物r(P2) 2.4μL
rTaq 酶 0.2μL
灭菌蒸馏水 43.8μL
所有试剂按量仔细添加后,轻轻混匀,稍离心即可.然后每支PCR 涂抹反应管内分装9μL 为了防止反应混合液蒸发,最后添加15μL 矿物油
PCR 仪的参数设置
94℃ 4min
94℃ 30s
61℃ 30s
40 cycles
72℃ 50
72℃ 5min
琼脂糖凝胶电泳检测:
PCR 反应结束后，往每只PCR 反应管加入2μL 的6×loading buffer,稍离心混匀后从每支PCR 管中取6μL 产品点样,电泳15min.观察产物带。
3、配置LB 液体培养基， 称胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g ，NaCl 10g 于1000ml
的三角瓶中，加入1000ml 蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口。
并把电泳结果中有荧光条带的4个样品分别接种到装有15ml 培养液的锥形瓶中，然后将锥形瓶放置到摇床中过夜恒温培养，于第二天观察菌株生长情况。
五、 实验结果及分析
1 2 3 4 5 6 （这是我们小组的6个样本）
图一 菌落直接PCR 电泳图
结果分析：有电泳图中可以看出六个电泳样本中第1、2、3、4、6号泳带都扩增出特异性条带，表明这五个菌落的菌PCR结果为阳性，说明第1、2、3、4、6号菌是所需鉴定的重组子。
我们选取了1、3、4、6号这4个样本做了下面的摇菌培养处理，实验效果图如下：
1号 3号阴性对照阳性对照
4号 6号阴性对照阳性对照
图二摇瓶培养的菌落生长情况
结果分析：从摇菌结果可以看出3号，6号菌株出现了荧光效果（图片由于像素原因只能看出浅浅的绿光），因此可以得出结论3号、6号菌是成功转化并表达GFP荧光蛋白的菌株，实验结果符合实验预期。
六、参考文献
《生物工程上游技术实验书册》田长恩科学出版社《基因工程技术》冯斌谢先芝编著化学化工出版社《生物技术综合实验》刘晓晴编科学出版社。