单克隆抗体
简述单克隆抗体的制备原理
简述单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体是指由单个B细胞克隆所产生的同一种抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
制备单克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
制备单克隆抗体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物
首先需要选取与目标抗原相关的免疫原来免疫动物，一般常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、细胞表面分子等。
免疫动物可以选择小鼠、大鼠、兔子等。
2. 分离B细胞
将免疫动物的脾脏取出，制备成单细胞悬液，然后通过离心、梯度离心等方法分离出B细胞。
B细胞是免疫系统中产生抗体的主要细胞类型。
3. 杂交瘤的制备
将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞是一种白血病细胞，具有无限增殖的能力，但不产生抗体。
通过融合，可以将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤细胞的无限增殖能力结合在一起，形成具有两种细胞的特点的杂交瘤细胞。
4. 筛选单克隆抗体
将杂交瘤细胞进行分离和培养，筛选出产生特定抗原的单克隆抗体。
可以通过酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方法鉴定和筛选出单克隆抗体。
5. 大规模制备和纯化
通过大规模培养杂交瘤细胞，可以得到足够数量的单克隆抗体，然后通过柱层析、电泳等方法对单克隆抗体进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体的制备过程需要经过免疫动物、分离B细胞、杂交瘤的制备、筛选单克隆抗体和大规模制备和纯化等步骤。
这些步骤需要严格控制条件和技术，以确保制备出高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体技术名词解释
单克隆抗体技术是近年来发展起来的一项重要技术，它主要利用免疫原性特异性表位，通过特定抗原诱导的方式，让免疫系统产生特异的抗体，以检测和鉴定特定的抗原，已经
成为生物学研究中的一项重要技术。
首先要了解单克隆抗体技术，需要先搞清楚一些基本名词：
1、抗原（Antigen）：抗原是一种可以诱导免疫系统产生特异性抗体的物质，具有免
疫原性，它是免疫系统反应的特异性标志物，也是单克隆抗体技术的基础。
2、抗体（Antibody）：抗体是一种特异性免疫球蛋白，能够与抗原结合形成复合物，从而发挥抗原的作用。
3、克隆（Clone）：克隆是指用同一种抗体制备出的一类特异性抗体，它们不仅具有
特异性，而且具有相同的抗原性。
4、单克隆抗体（Monoclonal Antibody）：单克隆抗体是指一种克隆抗体，它们不仅
具有特异性，而且只有一种抗原性，以及一种特定的抗原表位。
5、多克隆抗体（Polyclonal Antibody）：多克隆抗体是指一种克隆抗体，它们不仅具有特异性，而且有不同的抗原性，以及多种特定的抗原表位。
单克隆抗体技术是一项重要的技术，它主要应用于生物学技术研究，如免疫学、分子
生物学等，可用于检测和鉴定抗原，为生物学研究提供重要的帮助。
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
单克隆抗体的作用机制
单克隆抗体的作用机制
单克隆抗体是一种由单一克隆细胞制备的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它的作用机制主要包括抗原结合、中和、调控免疫应答和药物递送等方面。
单克隆抗体的主要作用是与特定抗原结合。
抗原通常是一种能够识别和结合抗体的分子，可以是细菌、病毒、肿瘤细胞表面的蛋白质，也可以是其他外源性分子。
单克隆抗体通过其可变区域与抗原的特定表位结合，形成抗原-抗体复合物。
这种结合可以通过多种方式发挥作用，如阻断病原体与细胞的结合，抑制病原体的生长和扩散，或者激活免疫系统攻击病原体等。
单克隆抗体还可以参与病原体的中和作用。
中和是指单克隆抗体与病原体结合后，阻止其进入宿主细胞并发挥病原作用。
这种作用机制通常涉及抗体的Fc区域与宿主细胞的Fc受体结合，从而促使病原体被巨噬细胞吞噬和消灭。
此外，单克隆抗体还可以通过激活补体系统来促进病原体的中和和清除。
单克隆抗体还可以调控免疫应答。
当机体感染病原体时，单克隆抗体可以与抗原结合，激活免疫系统产生炎症反应和免疫细胞的增殖和分化。
这种调控作用可以增强机体对病原体的清除能力，并促进免疫系统的适应性免疫应答。
单克隆抗体还可以被用作药物递送系统。
由于其高度特异性和亲和
力，单克隆抗体可以被设计成载体，用于输送药物到特定细胞或组织。
这种药物递送系统可以提高药物的效果和减少副作用，是一种有潜力的治疗策略。
单克隆抗体通过与特定抗原结合、中和病原体、调控免疫应答和药物递送等多种机制发挥作用。
它在疾病的预防和治疗中具有广泛的应用前景，为研发新型抗体药物提供了重要的理论和实践基础。
单克隆抗体
克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一 般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞 有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤 细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所 以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性 强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、 软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
周期第1天采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清） 第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂） 第14天第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第21天采血和ELISA检测 第35天第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第42天采血和ELISA检测 第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水） 第61天细胞融合
细胞融合
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或 5:1最为常用。
1．试剂与材料 (1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (2)1640培养液100ml。 (3)完全1640液100ml。 (4)2.5%FCS－1640液50ml。 (5)HAT培养液100ml。 (6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热 于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。 (7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。 (8)40孔塑料培养盘。
单克隆抗体的名词解释
单克隆抗体的名词解释单克隆抗体（Monoclonal Antibody）是一种由单一细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和单一的免疫活性。
它是分子生物学和免疫学领域的一项重要研究成果，被广泛应用于医学、生物技术和药物研发领域。
1. 抗体的基本概念抗体，也被称为免疫球蛋白，是人体免疫系统中的一种主要成分。
它由免疫细胞分泌，用于识别和中和入侵机体的外来物质（抗原），包括细菌、病毒等。
抗体的结构由重链和轻链组成，形成Y型。
抗体通过与抗原结合，可以促使免疫细胞对其进行消灭。
2. 单克隆抗体的产生过程单克隆抗体的产生主要通过杂交瘤技术实现。
杂交瘤是一种由癌细胞和免疫细胞融合形成的细胞系，具有不同细胞系的特点。
通过将免疫细胞与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞，可以实现对特定抗原的高产抗体。
然后，从杂交瘤细胞中筛选出目标抗体，进行克隆和扩增。
3. 单克隆抗体的优势相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有以下优势：3.1 高度特异性单克隆抗体通过针对特定抗原进行筛选和克隆，保证了抗体的高度特异性。
这意味着单克隆抗体可以更准确地识别和结合目标抗原，提高了诊断和治疗的准确性和有效性。
3.2 稳定性由于单克隆抗体是由单一细胞克隆得到的，其产生的抗体都具有相同的结构和特性。
相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的稳定性，不易受到批次差异的影响。
3.3 大规模生产经过克隆与扩增后，单克隆抗体可以在体外大规模生产。
这种高通量的生产方式可以满足临床和科研的需要，为抗体药物的发展和临床应用提供了可行性。
4. 单克隆抗体的应用领域由于其优越的性能，单克隆抗体在医学和生物技术领域得到了广泛的应用。
4.1 诊断单克隆抗体作为特异性的识别分子，可以用于临床诊断，检测和鉴定疾病和感染的相关指标。
例如，肿瘤标志物检测中常用的抗体检测方法就是应用单克隆抗体。
4.2 治疗单克隆抗体也被应用于治疗领域，发展出了一类被称为抗体药物的新型治疗药物。
这些药物可以通过特异性地结合和中和靶标分子，实现对疾病的治疗。
单克隆抗体特点
单克隆抗体特点单克隆抗体（即单克隆抗体，简称scAb）是一类专门用于识别目标抗原的抗体，是抗体的一种特殊类型，它们可以用于诊断、治疗及研究用途。
单克隆抗体的发现和开发为研究小分子抗原和乳腺癌治疗提供了新的机遇，已经发挥出重要作用。
单克隆抗体具有多种特点，其中可以作为主要特点的有：一、强高特异性。
单克隆抗体是一种特异性高的抗体，它们可以很快、准确地识别出特定抗原，而不会引起与其他抗原和小分子的误识别，从而可以实现精确的抗原检测和分析。
二、体外易表达。
单克隆抗体的开发需要在体外表达，其表达方法不需要利用自发性发育的免疫系统，而是在培养细胞中通过转染诱导重组基因的表达来获得，操作简单，表达效率高，无需进行有毒蛋白筛选，因此可以大规模生产抗体。
三、中心不变性好。
单克隆抗体的完整性很好，因此它们在不同的生物培养环境中表现出相对稳定的特性，其免疫原性具有中心不变性，生物学活性几乎不受外界环境的影响。
四、体内稳定性好。
由于单克隆抗体的结构特点，它们不容易被体内的酶分解，具有较好的体内稳定性，且可以被较长时间内的抗原识别和激活，从而达到良好的疗效。
单克隆抗体由于具有较高的特异性、耐受性及稳定性，使其在诊断、治疗及研究等领域得到了越来越多的应用。
例如，它可以用于检测蛋白质及小分子，进行药物开发和病原体检测，以及用于免疫疗法、癌症免疫治疗等。
此外，单克隆抗体还可用于治疗糖尿病、心脏病和感染病等疾病，并有望改变疾病治疗的局面。
总之，单克隆抗体的发现和开发不仅可以为研究小分子抗原和乳腺癌治疗提供新的机遇，而且具有多种特点，在诊断、治疗及研究等领域有着重要的应用价值，有望改变疾病治疗的局面，具有很大的发展前景。
单克隆抗体的应用及原理
单克隆抗体的应用及原理单克隆抗体是指由单一细胞株产生的、只针对特定抗原的抗体。
相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性和稳定性，因此在医学、生物学、生物技术等领域有着广泛的应用。
本文将从单克隆抗体的原理、制备方法和应用三个方面进行介绍。
一、单克隆抗体的原理单克隆抗体的制备基于生物学中的免疫原理。
当机体受到外来抗原的侵袭时，免疫系统会产生对抗原的免疫应答，其中的一种反应是产生抗体。
抗体是一种由免疫细胞（主要是B细胞）合成的蛋白质，它可以结合到抗原表面的特定区域（抗原决定簇，Epitope），从而识别和中和抗原。
抗体的结构包括两个重链和两个轻链，每个链都含有一个可变区（variable region，V区）和一个恒定区（constant region，C区）。
V区是抗体分子中最为多样化的部分，它决定了抗体的特异性。
当抗原与B细胞表面的抗体结合后，B细胞会被激活并分化成浆细胞，进而产生大量的抗体分子。
单克隆抗体的制备过程中，需要先制备出特定的抗原。
然后，将该抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
接着，从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，并将其与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤（hybridoma）的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
在一系列的筛选和鉴定过程中，可以筛选出只针对特定抗原的单克隆抗体细胞株，进而大规模制备单克隆抗体。
二、单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：1. 抗原的制备：首先需要准备出特定的抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类、药物等。
2. 动物免疫：将抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
注射的方式有多种，如皮下注射、腹腔注射、静脉注射等。
3. B细胞的分离：从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，可以使用离心、梯度离心等方法。
4. 杂交瘤的制备：将B细胞与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
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三、 免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏， 研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎 红细胞后，洗涤并调整到（1～5）X107 个／ml浓度备用
四、 细胞融合
将免疫脾B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照 （5～10）：1混合后离心取上清，缓慢 加入分子量在4000～6000的50％PEG 1ml， 间隔1分钟后，缓慢加入无血清培养基， 终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂 后加入细胞培养液，分种于96孔板中
第三节 杂交瘤技术与单克隆抗体
1975 年 ， 德 国 学 者 Kohler 和 英 国 学 者 Milstein 合作研究将经绵羊红细胞免疫后的 小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了 能持续分泌抗棉样细胞抗体的杂交瘤细胞， 从而创立了具有划时代意义的新技术，为此 获得了1984年医学诺贝尔奖
一、抗体的种类
五、特异杂交瘤细胞的选择
1. 杂交瘤细胞的选择
融合后，有杂交瘤细胞有骨髓瘤－B 淋巴细胞、 B 淋巴瘤细胞－ B 淋巴瘤 细胞、骨髓瘤细胞－骨髓瘤细胞， 还有未融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细 胞 一般用HAT培养液进行筛选
2. 特异性抗体的筛选
筛选出的杂交瘤细胞并不是都能分泌所 期望的抗体，所以还要对杂交瘤细胞做 的二次筛选，即对所分泌的抗体进行检 测。 一般地，细胞培养的上清液中，抗体可 以达到每毫升微克级的水平，目前检测 方法的灵敏度都可以达到。实验室常用 的是酶联免疫的方法，即ELISA方法
单克隆抗体的特点
抗体结构高度均一。抗体分子在结构上高度 均一，甚至在氨基酸的序列和空间结构上都 相同 高度特异性。抗体识别的是抗原分子上单一 的抗原位区 稳定的生产特性。产生抗体的细胞是可以无 性繁殖的细胞系
第四节 杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1. 抗原 凡是能具有抗原性质的物质均可制备单 克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位 或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、 脂类等 用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲， 纯度要求就可以不高，也可以使混合抗 原
目前杂交瘤技术在免疫学领域的应用 有两种 B淋巴细胞杂交瘤，即用骨髓瘤细胞和 B淋巴细胞进行融合而制备抗体，也是 引用最广泛的一种 T 细胞杂交瘤技术，肿瘤细胞和 T 细胞 融合而制备具有免疫活性的淋巴因子 通常人们所述的杂交瘤技术即知B淋巴 细胞杂交瘤，也可称为单克隆抗体技 术
三、单克隆抗体
单克隆抗体是由一个骨髓瘤细胞和一 个具有分泌抗体能力的B淋巴细胞融合 形成的杂交瘤细胞，通过无性繁殖形 成的细胞系 而获得的 这个细胞系的每个细胞均具有相同的 特性且高度均一，这一细胞系分泌的 抗体均一性极高，活性、亚基、亲合 力均相同
抗体制药
第一节 免疫学基础
一、疫学有关概念
抗原 抗体 免疫球蛋白 免疫佐剂
1. 抗原
1）概念 抗原是指能刺激机体免疫系统发生免疫 反应，并能与其产生的抗体和（或）致 敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结 合的物质 2）抗原特性 两个基本性质：免疫原性和反应原性
3）抗原构成的条件
A.异物性构成免疫原性的首要条件 免疫系统对异物的识别功能，是机体在发育中 建立起来的 B. 化学组成 C. 分子大小与其结构 D. 立体构象与易接近性 E. 其他条件 受到免疫途径、剂量以及机体方面等因素的影 响
通过细胞工程或基因工程生产的，用于诊 断或治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因 工程改造的抗体或免疫偶联物统称为抗体 药物
二、抗体药物特点
1. 特异性 1）与相关抗原的特异性结合 2）对靶细胞的选择性 2. 多样性 1）抗原多样性 2）结构多样性 3） 抗体活性的多样性 4）免疫偶联物和融合蛋白的多样性
3. 免疫球蛋白
4. 免疫佐剂
与抗原同时或预先注射到机体内，能增强 机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类 型的物质，称为免疫佐剂。
1）无机化合物 2）人工合成的双链多聚核苷酸 3）微生物及其产物 4）油剂
二、免疫系统
1. 免疫器官
2. 免疫细胞
3. 免疫分子
第二节 抗体药物概念及其特点
一、抗体药物概念
2. 抗体
抗体是机体免疫系统受抗原刺激后产生的 一类能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋 白。
免疫球蛋白的基本结构是四体单链构成的 单体 人的免疫球蛋白有IgA、IgD、IgM、IgG、 IgE 在可变区中，某些特定区域的氨基酸显示 出更大的变异性，称为高可变区，变化较 少的部分称为骨架区 高度可变区是免疫球蛋白分子与抗原决定 族发生特异性结合的部位，又称为互补决 定区（CDR）
1. 多克隆抗体 对克隆抗体含有两层意思：一是有含多个抗原 位区的大分子刺激产生的、识别不同抗原位区 的各种抗体；二是由体内不同淋巴细胞产生的、 可针对同一抗原位区的多克隆抗体。 2. 单克隆抗体 仅识别抗原分子上同一抗原位区的由同一克隆 细胞产生的抗体为单克隆抗体
二、杂交瘤及杂交瘤技术
细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合 或是在诱导物的作用下不同细胞间的融 合 淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞 形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞 通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于 某些细胞特性的研究和生产所期望的免 疫分子，称为杂交瘤技术
2. 免疫
动物的选择 目前常用的骨髓瘤细胞系来自 BALB/c 小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 体内免疫法 B. 脾内免疫法 C. 体外免疫法
二、 骨髓Байду номын сангаас细胞的选择
在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多 发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细 胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分 泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表 达自身抗体或部分表达 常见的骨髓瘤亲本细胞系有 Sp2/0，NS-1， Y3，YB2。
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1. 杂交瘤细胞的克隆化
2. 杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1. 动物体内诱生法
2. 体外培养法
八、单克隆抗体生产的一般流程
体外培养的骨髓瘤细胞 免疫纯系小鼠，取脾脏细胞
体外融合 HAT选择培养 抗体检测，阳性孔
克隆化培养，抗体检测
阳性克隆扩大培养 冻存细胞，建立细胞库